小鼠TIE2基因启动子的克隆及转录活性分析

克隆小鼠TIE2基因的启动子并分析其转录活性.设计并合成引物,以小鼠肝脏组织DNA为模板,巢式PCR扩增小鼠TIE2基因启动子区.将扩增获得的系列截短片段克隆入荧光素酶(Luc)报告基因表达载体pGL3-Basic中,构建系列启动子区转录活性报告质粒pGL3-TIE2-Luc.报告质粒与内参质粒共转染SVEC4-10、NIH3T3、HUVEC及NIT-1细胞系,48h后收获细胞检测双荧光素酶的表达情况.构建的pGL3-TIE2-Luc系列报告质粒经过酶切鉴定及DNA测序分析都显示正确;转染4种细胞系后进行双荧光素酶活性检测的结果表明,TIE2基因启动子区域(-2056-+1)具有较强的转录活性.成功构建小鼠TIE2基因启动子报告质粒,证实TIE2基因上游区域(-2056-+1)具有较强的启动子活性.     

关岭牛MyoD玉基因启动子报告质粒的构建及活性验证

为了克隆关岭牛MyoD玉基因启动子并验证其启动活性,根据GenBank中牛的MyoD玉基因序列设计PCR引物,用PCR技术扩增牛MyoD玉基因的启动子,构建重组克隆载体pUCmT-MyoD玉;并通过PCR扩增、限制性酶切、测序及生物信息学分析对阳性克隆进行鉴定;构建报告质粒pGL3-MyoD玉,并将其转染小鼠C2C12、3T3-L1细胞系,检测其24 h后的双荧光素酶活性。实验结果获得了关岭牛MyoD玉基因启动子,其序列长度为993 bp,并成功构建了MyoD玉启动子报告质粒;双荧光素酶活性检测表明pGL3-MyoD玉在小鼠C2C12细胞中的表达是pGL3空载体40.65倍,在小鼠3T3-L1细胞中的表达是空载体的1.13倍,MyoD玉启动子在小鼠C2C12细胞中的表达高于3T3-L1细胞(**p<0.01)。结果表明关岭牛MyoD玉基因启动子具有启动活性,在小鼠骨骼肌细胞中特异性表达。     

小鼠Lrp5基因启动子的克隆及功能分析

为分析小鼠LDL受体相关蛋白 5 (Lrp5 )基因启动子的结构与功能 ,采用DNA重组技术 ,构建了 7种含小鼠Lrp5基因启动子荧光素酶报告基因表达体系 ,分别为 :pGL3 10 3(- 10 3bp～ + 132bp) ,pGL3 30 3(- 30 3bp～ + 132bp) ,pGL3 4 99(- 499bp～ + 132bp) ,pGL3 70 8(- 70 8bp～ + 132bp) ,pGL3 90 9(- 90 9bp～ + 132bp) ,pGL3 10 34(- 10 34bp～ + 132bp ) ,pGL3 12 2 9(- 12 2 9bp～ + 132bp) .以pRL TK为内参照质粒 ,瞬时转染成骨细胞株 (U2OS )及非成骨细胞株 (COS 7) ,收集细胞测定荧光素酶相对表达活性 .7种荧光素酶表达质粒在 2种细胞中表达无显著差异 ,即在所分析的小鼠Lrp5基因的 136 1bp(- 12 2 9bp～ + 132bp)范围内 ,不存在成骨细胞特异的表达元件 ;而且 7种表达质粒在 2种细胞中呈现相似的变化趋势 ,pGL3 10 3表达活性最高 ,pGL3 12 2 9表达活性显著降低 .表明小鼠Lrp5基因转录所必需的基本启动子序列在 - 10 3bp～ + 1bp范围内 ,- 10 34bp～ - 12 2 9bp之间的 195bp片段内可能含有负调控元件 .     

Dppa2 基因启动子区Oct4 结合位点突变对其活性的影响

目的：探讨Dppa2 基因5'' 端启动子区Oct4 结合位点突变对Dppa2基因启动子活性的影响。方法：PCR 扩增包括Oct4 结合 位点的Dppa2 基因5'' 端转录起始点上游-2439～+293 bp 的启动子序列,片段长度为2732 bp。将该片段连接到pGL3-Basic 载体, 构建野生型pGL3-2439表达载体。采用定点突变法,将-1959～-1957 位碱基的GCA突变成TAG,构建Oct4 结合位点突变型 pGL3-mo2439 表达载体。用上述两种表达载体、PGL3-basic 载体和Oct4 表达载体分别瞬时转染HEK 293 细胞。细胞培养48 h 后,利用双荧光素酶报告系统测定各组细胞表达的荧光素酶的相对活性。结果：经琼脂糖凝胶电泳及测序鉴定,证实野生型 (pGL3-2439)和突变型(pGL3-mo2439)载体构建成功。荧光素酶活性测定结果显示,转染Dapp2 基因启动子野生型pGL3-2439 表 达载体的细胞组荧光素酶的相对活性为16.307,突变型pGL3-mo2439 表达载体的细胞组荧光素酶的相对活性为10.634。Oct4 结 合位点突变后,Dppa2 基因启动子区转录活性较野生型降低了35 %。结论：Dppa2基因5''端启动子区-1959～-1957 位的Oct4 结 合位点突变可能导致Dppa2 基因启动子活性下降     

miR-181b-5p 对于卡波西肉瘤细胞SLK细胞增殖和凋亡的影响

目的：探讨Dppa2 基因5'' 端启动子区Oct4 结合位点突变对Dppa2基因启动子活性的影响。方法：PCR 扩增包括Oct4 结合 位点的Dppa2 基因5'' 端转录起始点上游-2439～+293 bp 的启动子序列,片段长度为2732 bp。将该片段连接到pGL3-Basic 载体, 构建野生型pGL3-2439表达载体。采用定点突变法,将-1959～-1957 位碱基的GCA突变成TAG,构建Oct4 结合位点突变型 pGL3-mo2439 表达载体。用上述两种表达载体、PGL3-basic 载体和Oct4 表达载体分别瞬时转染HEK 293 细胞。细胞培养48 h 后,利用双荧光素酶报告系统测定各组细胞表达的荧光素酶的相对活性。结果：经琼脂糖凝胶电泳及测序鉴定,证实野生型 (pGL3-2439)和突变型(pGL3-mo2439)载体构建成功。荧光素酶活性测定结果显示,转染Dapp2 基因启动子野生型pGL3-2439 表 达载体的细胞组荧光素酶的相对活性为16.307,突变型pGL3-mo2439 表达载体的细胞组荧光素酶的相对活性为10.634。Oct4 结 合位点突变后,Dppa2 基因启动子区转录活性较野生型降低了35 %。结论：Dppa2基因5''端启动子区-1959～-1957 位的Oct4 结 合位点突变可能导致Dppa2 基因启动子活性下降。     

EphA3基因启动子区域定位表达及活性分析

目的构建含有不同长度EphA3基因启动子片段的报告基因载体,研究其在293T细胞和MEF细胞中的转录活性。方法以Balb／C小鼠基因组DNA为模板,扩增不同长度的EphA3基因启动子片段,并克隆进入荧光素酶报告基因质粒pGL3-Basic真核表达载体内。酶切鉴定及基因测序无误后,将重组质粒和pRL—CMV内对照质粒共转染293T和MEF细胞,分析不同长度的OhA3基因启动子片段的转录活性。结果酶切和测序鉴定表明表达载体构建成功,EphA3基因的核心启动子区域位于-279bp～＋110bp之间,在293T细胞和MEF细胞中其转录活性相似。结论成功构建了荧光素报告基因重组质粒,并确定了BphA3基因的核心启动子区域。     

含G0S2基因启动子的荧光素酶报告基因载体的构建

目的:克隆人G0S2基因启动子并构建荧光素酶报告基因载体,为进一步研究G0S2基因转录调控提供质粒。方法:利用PCR技术从人胚肾293A细胞基因组DNA中克隆获得G0S2基因启动子的DNA片段,将其克隆至pGL3-basic表达载体中,并转化人大肠杆菌DH5α,经限制性内切酶酶切、PCR及测序鉴定得到确认;将重组载体质粒与半乳糖苷酶表达质粒psV-β-Galactosidase共转染至大鼠血管平滑肌细胞(VSMC),检测细胞中荧光素酶的活性。结果:pGL3-G0S2-Promoter重组质粒插入片段和相邻序列正确,克隆的G0S2基因片段有启动子活性(P0.05)。结论:成功构建了pGL3-G0S2-Promoter报告基因质粒,为进一步研究G0S2基因的表达奠定了基础。     

大鼠GluR2基因启动子控制的萤火虫荧光素酶表达载体的构建

目的构建大鼠GluR2基因启动子控制的萤火虫荧光素酶表达载体,并检测其在神经元中的表达。方法采用PCR方法获得GluR2基因启动子区目的片段（-298～＋283）,双酶切后插入到pGL3-Basic载体中构成重组表达载体,使萤火虫荧光素酶报告基因的表达受GluR2启动子控制。将构建的重组表达载体或pGL3-Basic载体分别与内参质粒pRL—CMV（表达海肾荧光素酶）共转染原代培养皮质神经元,24h后用双荧光检测试剂盒测定萤火虫荧光素酶及海肾荧光素酶活性。结果重组表达载体经双酶切及测序鉴定证明构建正确,该重组表达载体在神经元中特异性高表达萤火虫荧光素酶。结论成功构建大鼠GluR2基因启动子控制的萤火虫荧光素酶表达载体,并检测到该载体在神经元中的特异性表达。     

肌肉LIM蛋白增强生肌素对AChRγ启动子的反式激活作用

采用RT PCR技术克隆了大鼠肌肉LIM蛋白 (MLP) 6 40bp的全长cDNA序列 .以此cDNA为探针进行的Northern印迹表明 ,MLP于C2C12细胞在分化的第 3d至第 5d表达 .将MLPcDNA亚克隆至pcDNA3,构建真核表达质粒pcDNA3 MLP ,同时构建AChRγ启动子序列 (96 0bp)调控的荧光素酶报告基因真核表达质粒pGL3 γ .C2C12细胞转染及荧光素酶活性分析表明 ,复合转染pcD NA3 MLP和pGL3 γ的分化肌细胞表达的荧光素酶活性约为对照的 4倍 ;而在 3T3或未分化肌细胞复合转染pcDNA3 MLP和pGL3 γ均未检出报告基因表达 ,说明MLP可促进生肌素对AChRγ亚基基因启动子的反式激活作用 .     

人β1整合素启动子核心启动序列初步分析

目的:分析人β1整合素在HaCat细胞中核心启动片段.方法:以本室构建的含整合素β1全长启动子1745 bp基因序列(-1745bp～+11 bp)的重组栽体pGL3-1756为模板,用含有酶切位点的特异性引物扩增出整合素β1启动子-845 bp～304bp间基因序列,克隆至荧光素酶表达载体pGL3 basic,构建含正确目的基因重组载体pGL3-542.用pGL3-1756、和pGL3-542质粒转染人表皮细胞株HaCat进行活性分析.结果:酶切及序列测定表明,克隆后插入pGL3 basic中的启动子片段与GenBank DNA序列数据库对比分析序列一致,且插入方向正确.在人永生化表皮细胞株(HaCat细胞)中构建的pGL3-542载体具有很强的启动活性.结论:成功构建了整合素Bl远端启动子542 bp片段载体,在HaCat细胞中具有非常强的启动活性.人整合素β1整合素启动子核心启动序列可能位于-845 bp～-304 bp.     

小鼠Lrp5基因5′端调控区域的功能

为研究小鼠低密度脂蛋白(LDL)受体相关蛋白5(LRP5)基因5′端调控序列的功能,PCR扩增小鼠Lrp5基因翻译起始位点上游3041bp(-2909bp~+132bp)DNA序列.PCR产物定向克隆到pGL3-basic载体上,重组质粒命名为pGL3-2909.以pGL3-2909质粒为模板,以不同的引物扩增出不同长短的DNA片段,分别定向克隆到含小鼠Lrp5基因基本启动子并含有荧光素酶报道基因的pGL3-103载体上,构建了12种荧光素酶报告基因表达体系:pGL3-267,pGL3-513,pGL3-535,pGL3-560,pGL3-575,pGL3-623,pGL3-645,pGL3-719,pGL3-770,pGL3-1032,pGL3-1330,pGL3-1619.以pRL-TK为内参照质粒,瞬时转染COS-7细胞,48h后收集细胞测定荧光素酶相对表达活性,pGL3-575(-2909bp~-2334bp)活性是pGL3-513(-2909bp~-2396bp)的20%,pGL3-535(-2909bp~-2374bp)的活性是pGL3-513的44%,pGL3-575的活性是pGL3-560(-2909bp~-2349bp)的48%,均有显著性差异.结果表明,在-2396bp与-2374bp之间的22bp区域内以及-2349bp与-2334bp之间的15bp区域内存在负调控元件.软件分析表明,此区域含有IK2,LYF1及MZF1调控元件.     

Effect of copper,zinc and cadmium on the promoter of selenoprotein W in glial and myoblast cells

Rat selenoprotein W (SeW) promoter activity was investigated using different concentrations of cadmium, copper, and zinc. Two fragments (404 and 1265 bp) of the SeW promoter, containing a single metal response element (MRE), were ligated into the multiple cloning site of a pGL3-Basic reporter plasmid. The constructs were transfected into cultured C6 (rat glial) and L8 (myoblast) cells and promoter activity measured by means of luciferase reporter gene fused to the SeW promoter fragments in the reporter plasmid. With post-transfection exposure of these cell lines to these metals, copper and zinc, but not cadmium, significantly increased promoter activity of the unmutated 1265 bp (not 404 bp) construct (p<0.05) only in the C6 cells. Mutation of the MRE sequence abolished promoter response to metal exposure but did not eliminate promoter activity. The results suggest that SeW expression in glial cells can be increased on exposure to copper and zinc and that this response is dependent on the MRE sequence present in the SeW promoter.     

PD-1核心启动子的获得及活性鉴定

目的:构建PD-1(programmed death receptor 1)全长启动子及不同截短体的报告基因,并对其转录活性进行检测。方法:通过PCR及双酶切方法,从人全血基因组DNA中获得PD-1基因编码序列,包含不同长度碱基的PD-1启动子序列,分别克隆到报告基因pGL3-Basic载体上,构建8个不同长度PD-1启动子的报告基因;用脂质体转染法将8个报告基因分别转染至Jurkat细胞系;采用双萤光素酶报告基因系统评估PD-1启动子的活性。结果:经PCR方法扩增出大小分别为1650、1450、1250、1128、874、674、474和274 bp的不同长度的PD-1启动子序列,测序正确(与GenBank报道一致),酶切鉴定正确;瞬时转染Jurkat细胞系后经报告基因检测,8个启动子均具有转录活性。结论:构建了PD-1启动子的报告基因,并证实均有转录活性,且以pGL3-1128活性最高,为PD-1的核心启动子,为进一步研究PD-1的转录调控奠定了实验基础。     

人端粒酶催化亚基基因启动子调控的肿瘤细胞特异表达载体

为获得端粒酶阳性肿瘤细胞特异表达载体用于癌症的基因治疗 ,克隆并构建了人端粒酶催化亚基 (hTERT)基因启动子调控的萤光素酶报告载体 .用脂质体转染法将其分别转染肿瘤细胞和正常细胞 ,检测其在肿瘤细胞和正常细胞中的转录活性 .hTERT启动子在所检测的 4种端粒酶阳性的肿瘤细胞中具有明显的转录活性 ,平均为阳性对照的 4 4 3% ;而在端粒酶阴性的正常人胚肺成纤维细胞中则无明显的转录活性 .提示hTRET启动子的转录活性在端粒酶阳性的肿瘤细胞中明显上调 ,由hTERT启动子构建的载体可能是一种新颖和有前景的肿瘤细胞特异性表达的基因治疗载体     

徐州医学院病原生物学与免疫学教研室

目的:建立高活性的PSA启动子荧光素酶报告载体。方法:提取前列腺癌细胞PC-3总DNA,PCR扩增出PSA启动子片段,建立PSA启动子荧光素酶重组载体PGL3-psap,通过脂质体介导将重组载体转染到前列腺癌细胞PC-3中,使用荧光素酶检测系统检测其活性。结果:DNA测序结果表明成功构建荧光素酶重组载体PGL3-psap,荧光素酶检测显示重组载体在前列腺癌细胞PC-3中有较强活性。结论:本研究成功构建了具有高度活性的PSA启动子荧光素酶报告载体,为进一步研究前列腺癌的诊断和治疗提供了实验基础。     

CKLFSF1基因与CKLFSF2基因间存在的顺式作用元件

探讨趋化素样因子超家族成员 1,2基因 (CKLFSF1基因与CKLFSF2基因 )间的短序列对其下游基因表达的调控作用 .运用PCR技术扩增CKLFSF1基因与CKLFSF2基因间的序列 ,将此片段插入含有萤光素酶 (luciferase)报告基因载体上 .以磷酸钙介导基因转染技术 ,将重组质粒以及阴性和阳性对照组质粒转染到HeLa细胞 ,进行瞬时表达分析 .在pGL3 Basic质粒中的报告基因萤光素酶无表达 ,但将CKLFSF1与CKLFSF2基因间的序列插入到启动子上游或下游后 ,显著抑制其下游基因的表达 ,萤光素酶活性明显降低 .结果提示 ,CKLFSF1与CKLFSF2基因间的序列不具有启动子活性 ,但是该序列对其下游基因表达具有负调控作用     

法尼醇X受体激动剂细胞筛选体系的建立与优化

本研究旨在建立一种基于双荧光素酶报告基因检测体系的法尼醇X受体(farnesoid X receptor, FXR)激动剂细胞筛选体系,以满足对FXR激动剂先导化合物的高通量筛选。通过在报告基因质粒pGL4-luc2P-Hygro中的萤火虫荧光素酶(firefly luciferase,Luc)基因上游克隆并插入来自FXR靶基因的FXR反应元件(FXR response element,FXRE)片段,构建用于筛选FXR激动剂的报告基因质粒,并结合海肾荧光素酶内参质粒,建立能够有效反映药物对FXR激动效应的双荧光素酶报告基因细胞检测体系。通过一系列优化实验,比较了过表达RXR、鼠源和人源FXR、不同的FXRE片段、FXR过表达质粒与报告基因质粒的混合比对筛选体系诱导效率和灵敏度的影响。根据上述结果,最终确定了优化条件,优化后体系Z因子达到0.83。本研究建立了一种用于FXR激动剂筛选的改良的基于双荧光素酶报告基因检测体系的细胞筛选体系,其主要特征在于,使用多段FXR靶基因上的FXRE片段叠加组成一种新型的增强型FXRE元件,而非传统的反向重复序列-1 (inverted repeats...     

人FUT4基因近端启动子结构的初步分析

LeY是一种双岩藻糖化寡糖,在大多数上皮来源的肿瘤细胞（包括乳腺癌、卵巢癌等）中高表达.岩藻糖基转移酶Ⅳ（fucosyltransferase Ⅳ, FUT4）是合成LeY的关键酶. 前期工作发现,FUT4通过增加LeY糖的合成来促进细胞的增殖. 但有关FUT4的转录调控机制尚不清楚. 本文通过对人FUT4基因近端启动子进行生物信息学分析,并构建不同长度启动子序列荧光虫荧光素酶报告基因表达载体,分析其转录活性. 使用First EF程序分析并获得FUT4近端启动子序列,采用PCR 法扩增FUT4基因近端不同长度的启动子序列,定向克隆,获得不同长度的启动子重组质粒. 重组质粒经双酶切及测序鉴定正确. 荧光素酶活性分析不同长度的FUT4 基因启动子片段的转录活性.结果显示,pGL6-FUT4-1.2 kb在MCF-7和MDA- MB-231细胞中转录活性明显升高（P<0.05）.说明FUT4基因启动子区域定位于转 录起始位点上游的-800～-1 600 bp的区域内.