小鼠超数排卵优化试验方案研究

探讨建立一种适合贵州地区、高效、稳定的小鼠超数排卵优化方案。在饲养环境相同的基础上,对激素(PMSG, hCG)不同的剂量组合、注射间隔时间、小鼠周龄等影响因素进行了相关研究。试验结果表明:(1)平均采胚数量组间、平均异常胚组间与平均可用胚组间差异显著(p<0.05),注射10 IU的激素剂量组合获得受精卵最多,且异常胚最少,效果最佳。(2)第1、第2、第3组平均采胚数量组间差异显著(p<0.05),第1组与第2组平均可用胚组间差异不显著(p>0.05),但第1、2组与第3组差异显著(p<0.05),异常胚组间差异不显著(p>0.05),选择4周龄超排效果最佳。(3)第1、第2、第3组平均采胚数量、平均可用胚组间差异显著(p<0.05),平均异常胚组间差异不显著(p>0.05),PMSG,hCG间隔注射时间为48 h为最佳。     

甘草次酸对Bloom解旋酶生物学特性的影响

甘草次酸(glycyrrhetinic acid,GA)是甘草主要活性组分,可诱导肿瘤细胞凋亡,抑制肿瘤细胞生长.然而,其对BLM解旋酶的抑制作用尚未见报道.本文注视甘草次酸对BLM解旋酶构象、二级结构和生化活性的影响.圆二色光谱和紫外光谱分析显示,GA可破坏BLM642-1290解旋酶α-螺旋结构,改变其构象,并具有2个结合位点.采用荧光偏振技术和自由磷检测证明,GA以浓度依赖的方式抑制BLM642-1290解旋酶与底物dsDNA及ssDNA的结合,抑制BLM642-1290解旋酶活性及ATP酶活性,且抑制类型为混合抑制.综上所述,本文证明GA可通过结合BLM解旋酶,改变BLM解旋酶构象,抑制BLM解旋酶与DNA的结合,从而抑制BLM解旋酶的生化活性.我们的发现将对深入认识GA的抗肿瘤作用有新的启示.     

荧光偏振技术研究Bloom解旋酶催化核心与双链DNA的相互作用

Bloom 综合症(BLM)解旋酶是RecQ家族DNA解旋酶中的一个重要成员,参与了DNA复制、修复、转录、重组以及端粒的维持等细胞代谢过程,在维持染色体的稳定性中具有重要的作用．BLM解旋酶的突变可导致Bloom综合症,患者遗传不稳定易患多种类型癌症．本研究运用荧光偏振技术研究BLM解旋酶催化核心(BLM642-1290)与双链DNA(dsDNA)的相互作用,分析其相关特征参数,了解BLM642-1290解旋酶与dsDNA的结合和解链特性．结果表明,BLM642-1290解旋酶与dsDNA的结合和解链和dsDNA3’末端的单链DNA(ssDNA)长度有关;解旋酶优先结合于dsDNA底物的ssDNA末端,且每分子解旋酶可结合9.6 nt的ssDNA;dsDNA3’末端ssDNA的长度为9.6 nt时,解旋酶的解链效率达到最大且不再随其长度而变化．另外,BLM642-1290解旋酶也能够结合和解链钝末端dsDNA,但其结合亲和力和解链效率低于有3’末端ssDNA的dsDNA．推测BLM642-1290解旋酶在与dsDNA底物结合和解链时是单体形式,可能以尺蠖的形式解开dsDNA．这些结果可为进一步研究BLM解旋酶的功能特征提供理论基础．     

荧光偏振技术研究Bloom解旋酶催化核心与双链DNA的相互作用

Bloom 综合症(BLM)解旋酶是RecQ家族DNA解旋酶中的一个重要成员,参与了DNA复制、修复、转录、重组以及端粒的维持等细胞代谢过程,在维持染色体的稳定性中具有重要的作用．BLM解旋酶的突变可导致Bloom综合症,患者遗传不稳定易患多种类型癌症．本研究运用荧光偏振技术研究BLM解旋酶催化核心(BLM^642～1290)与双链DNA(dsDNA)的相互作用,分析其相关特征参数,了解BLM^642～1290解旋酶与dsDNA的结合和解链特性．结果表明：BLM^642～1290解旋酶与dsDNA的结合和解链与dsDNA 3′端的单链DNA(ssDNA)长度有关;解旋酶优先结合于dsDNA底物的ssDNA末端,且每分子解旋酶可结合9.6 nt的ssDNA;dsDNA 3′端ssDNA的长度为9.6 nt时,解旋酶的解链效率达到最大且不再随其长度而变化．另外,BLM^642～1290解旋酶也能够结合和解链钝末端dsDNA,但其结合亲和力和解链效率低于有3′端ssDNA的dsDNA．推测BLM^642～1290解旋酶在与dsDNA底物结合和解链时是单体形式,可能以尺蠖的形式解开dsDNA．这些结果可为进一步研究BLM解旋酶的功能特征提供理论基础．     

Bloom解旋酶突变体的克隆与表达

blm基因的突变可导致Bloom综合症(BS),Bloom综合症是一种罕见隐性常染色体遗传疾病,患者遗传不稳定并易患多种类型癌症。临床发现BS患者细胞中的BLM的RecQ-Ct区域的1 036位半胱氨酸残基发生突变。运用生物信息学及分子生物学技术,通过两轮重组PCR,构建985位和1 036位氨基酸突变的BLM解旋酶多点突变基因,克隆到载体pET-28a中,并转化至大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达。分离纯化获得了高纯度(>95%)的双突变型BLM解旋酶,并对其进行了Western blotting鉴定。这些结果可为进一步研究BS的致病机制奠定基础。     

贵州三个地方猪种的系统发育分析

采用PCR产物直接测序方法首次测定贵州3个地方猪种(白洗猪、从江香猪、黔北黑猪)共计57个个体线粒体DNA控制区的全序列,将它们与GenBank上已知的25个国内外猪种一起计算遗传距离,并构建系统发育树。结果表明,3个贵州地方猪种mtDNA D-loop区的序列长度为1 254-1 314 bp之间,贵州地方猪种遗传距离在0.002 9-0.007 2之间,白洗猪与黔北黑猪、从江香猪之间的距离最大,均为0.007 2。系统发育分析的结果支持中国家猪分别有南北两个母系起源的观点,且各地方猪种之间可能有基因交流。     

影响BLM基因表达的miRNAs筛选及抑制效率研究

[目的]筛选调控BLM基因表达的miRNAs并研究其抑制效率。[方法]利用Target Scan Human 6.2、microRNA.org、PicTar以及miRsystem在线软件预测调控BLM基因表达的miRNAs;miRNA通过脂质体转染和特异茎环引物反转录、荧光定量PCR及Pfaffl算法检测miRNA对BLM基因表达的影响。[结果]初步筛选出hsa-miR-338-3p为调控BLM基因表达的miRNA;hsa-miR-338-3p抑制效率试验结果表明:当前列腺癌细胞(PC3)转染20μmol/L的hsamiR-338-3p minic时,实验组BLM表达量为对照组的0.44倍,抑制了BLM的表达(P0.01);转染40μmol/L的hsa-miR-338-3p minic时,实验组BLM的表达量为对照组的2.55倍,促进了BLM的表达(P0.01);转染60μmol/L的hsa-miR-338-3p minic时,实验组BLM的表达量为对照组的1.14倍,实验组与对照组差异不显著(P0.05)。[结论]转染20μmol/L、40μmol/L和60μmol/L的hsa-miR-338-3p minic时BLM基因的表达量分别是对照组的0.44倍、2.55倍和1.44倍,转染不同剂量的miRNA对BLM基因的表达情况具有不同的影响。     

从江香猪TPM3基因的克隆与序列分析

[目的]对从江香猪TPM3基因进行扩增、克隆和序列分析。[方法]通过RT-PCR从猪背最长肌中扩增TPM3基因CDS区并进行克隆,利用DNAMAN和BioEdit等软件对克隆的序列进行分析。[结果]成功克隆了从江香猪TPM3基因并构建了pUCm-T-TPM3载体;获得了TPM3-1和TPM3-2两个序列,TPM3-1有两个碱基的差异,相似度达99.73%;TPM3-2有一个碱基的变化,同时插入了一段76 bp的片段,相似度达99.87%;密码子偏好性分析显示,UUG编码亮氨酸的频率为0.49%,而CUG编码亮氨酸的频率为2.89%,说明第49位碱基的转换可能提高蛋白的合成效率;RNA二级结构分析显示,碱基突变会影响TPM3基因RNA二级结构和最小自由能的变化;蛋白理化性质分析显示,氨基酸的改变对α螺旋、β折叠及转角等二级结构影响不明显。[结论]从江香猪TPM3基因的碱基突变可能影响原肌球蛋白的合成,为探究其对从江香猪肉质及种资源的开发利用提供试验依据。     

大肠杆菌RecQ解旋酶的表达纯化和生物学活性研究

RecQ家族解旋酶是DNA解旋酶中高度保守的一个重要家族,在维持染色体的稳定性中起着重要的作用.人类RecQ家族解旋酶突变会导致几种与癌症有关的疾病.本研究旨在诱导大肠杆菌RecQ解旋酶体外表达,并应用生物化学和生物物理学技术研究大肠杆菌RecQ解旋酶的生物学活性. 体外诱导表达获得纯度达90% 以上并具有高活性的大肠杆菌重组RecQ解旋酶,其可溶性好;经生物学活性分析显示具有DNA结合活性、ATP依赖的DNA解链活性、DNA依赖的ATP酶活性. 较之双链DNA（dsDNA）,大肠杆菌RecQ解旋酶更容易与单链DNA(ssDNA)结合( P<0.01 ),但与长度不同的dsDNA的结合特性有差异(P<0.01)而与ssDNA没有差异(P>0.05);大肠杆菌RecQ解旋酶对3种dsDNA的解链速率不同(P<0.05);大肠杆菌RecQ解旋酶的ATP酶活性与辅助因子ssDNA长度也呈正相关(P<0.01). 这些研究结果将有助于阐明大肠杆菌RecQ解旋酶的分子作用机制,并为研究RecQ解旋酶家族其它成员的结构与功能提供帮助.