人高致病性禽流感病毒H5N1安徽株HA、M2蛋白双顺反子表达载体的构建及表达研究

将我国分离的人H5N1亚型禽流感病毒A/Anhui/1/2005作为研究对象,扩增其HA和M2基因片段并克隆至DNA疫苗表达载体pVRC中,构建成真核表达质粒。为提高HA的表达量,按照人偏爱密码子将HA基因进行优化改造,经全基因合成后插入真核表达载体pVRC,以β-actin蛋白为内参比证明了优化后的HA蛋白表达效果明显提高。将M2基因和优化后的HA基因共同克隆入双顺反子表达载体pIRES中,获得同时表达HA或M2的双顺反子真核表达质粒;通过Western blot和间接免疫荧光检测方法,确认构建的重组质粒在真核细胞中成功地表达了目的蛋白HA和M2。通过上述结果为进一步开展人高致病性禽流感病毒安徽株HA和M2基因的功能与致病性研究及使用表达HA和M2蛋白进行新型人用禽流感双价疫苗研发奠定基础。     

牙龈卟啉单胞菌HA2基因和白细胞介素IL-15基因重组质粒的构建

构建抗牙龈卟啉单胞菌的牙周炎基因疫苗p VAX1-HA2、pVAX1-HA2/IL-15,体外检测其在293T细胞的表达。以HA2基因(牙龈卟啉单胞菌牙龈素—血凝素基因编码区的核心功能区)为目的基因与IL-15基因为免疫佐剂构建真核表达质粒,用Lip2000介导瞬时转染293T细胞,RT-PCR检测目的基因mRNA水平及酶联免疫吸附试验检测IL-15蛋白表达水平。重组质粒p VAX1-HA2、pVAX1-HA2/IL-15经酶切及DNA测序鉴定构建正确,转染的293T细胞能够检测到目的基因的表达,也可以检测到IL-15蛋白的表达。说明我们成功构建了真核共表达质粒pVAX1-HA2和p VAX1-HA2/IL-15,为下一步研制抗牙龈卟啉单胞菌DNA疫苗奠定了基础。     

人LC3B基因的真核表达及鉴定

目的:构建带HA标签的重组人LC3B基因的真核表达载体,获得HA-LC3B融合蛋白,并初步检测其生物学功能。方法:从人乳腺文库中通过PCR技术扩增LC3B基因编码序列,将其插入pc DNA3.0-HA载体,获得HA-LC3B真核表达载体;将重组质粒与空载体分别转染人胚肾293T细胞,通过Western印迹检测转染细胞的表达情况,免疫共沉淀实验证实其生物学活性。结果:双酶切和测序结果表明HA-LC3B真核表达质粒构建成功,Western印迹表明重组质粒转染293T细胞后获得表达;免疫共沉淀实验显示HA-LC3B融合蛋白可以和Atg4B蛋白相互作用,具有较好的生物学活性。结论:在真核表达系统中表达了带HA标签的人LC3B,为进一步研究细胞自噬奠定了基础。     

新疆株HPV-16 L1在真核细胞中表达水平的初探

以密码子优化的人乳头瘤病毒16型(HPV-16)主要衣壳蛋白基因L1作为对照研究新疆株HPV-16 L1在真核细胞中的表达水平.将新疆株HPV-16 L1与密码子优化的HPV-16 L1分别克隆入真核表达载体pcDNA3.1重组质粒通过水动力转染技术注入小鼠体内或采用脂质体法转染293T细胞,RT-PCR检测HPV-16 L1在小鼠肝脏及293T细胞中的转录:western印迹检测HPV-16 L1在293T细胞中表达的蛋白质.结果显示新疆株及密码子优化的HPV-16L1,在小鼠肝脏及293T细胞中均发生转录,但新疆株L1的表达水平显著低于密码子优化L1的表达水平.     

基因修饰对鸡新城疫病毒F48E9株HN基因DNA疫苗表达效力的影响

DNA疫苗的免疫效果与抗原基因的表达量和免疫原性有直接关系, 为了提高目的基因的表达量, 本研究对NDV F48E9株的HN基因进行了修饰, 对修饰前后HN基因表达水平进行了比较。利用分子生物学软件将NDV F48E9株的HN基因的密码子全部替换为鸡体内偏嗜性密码子, 同时在HN基因的5′端加上同样已替换密码子的禽流感病毒HA蛋白信号肽序列以期望提高目的蛋白在细胞中的表达。修饰后HN基因命名为SoptiHN, 剔除信号肽的HN基因命名为optiHN。将SoptiHN、optiHN和F48E9株的HN基因分别克隆到真核表达载体pVAX1和含有多个鸡体内最适免疫刺激序列CpG-ODN的载体pVAX1-CpG中, 将他们分别命名为pV-SoptiHN、pVC-SoptiHN、pV-optiHN、pVC-optiHN和pV-HN、 pVC-HN, 用这些质粒转染293T细胞, 48小时后间接免疫荧光和Western blotting检测细胞中瞬时表达的HN蛋白。结果显示, 与未经修饰的HN基因相比, 修饰后的HN基因体外瞬时表达水平明显提高, 并且密码子优化与添加信号肽序列这两种途径都可以提高HN基因的体外表达量。     

基因修饰对鸡新城疫病毒F48E9株HN基因DNA疫苗表达效力的影响

DNA疫苗的免疫效果与抗原基因的表达量和免疫原性有直接关系, 为了提高目的基因的表达量, 本研究对NDV F48E9株的HN基因进行了修饰, 对修饰前后HN基因表达水平进行了比较。利用分子生物学软件将NDV F48E9株的HN基因的密码子全部替换为鸡体内偏嗜性密码子, 同时在HN基因的5′端加上同样已替换密码子的禽流感病毒HA蛋白信号肽序列以期望提高目的蛋白在细胞中的表达。修饰后HN基因命名为SoptiHN, 剔除信号肽的HN基因命名为optiHN。将SoptiHN、optiHN和F48E9株的HN基因分别克隆到真核表达载体pVAX1和含有多个鸡体内最适免疫刺激序列CpG-ODN的载体pVAX1-CpG中, 将他们分别命名为pV-SoptiHN、pVC-SoptiHN、pV-optiHN、pVC-optiHN和pV-HN、 pVC-HN, 用这些质粒转染293T细胞, 48小时后间接免疫荧光和Western blotting检测细胞中瞬时表达的HN蛋白。结果显示, 与未经修饰的HN基因相比, 修饰后的HN基因体外瞬时表达水平明显提高, 并且密码子优化与添加信号肽序列这两种途径都可以提高HN基因的体外表达量。     

禽流感病毒HA基因真核表达质粒的构建与表达

血凝素蛋白（HA）基因是禽流感病毒（AIV）重要的保护性抗原基因.为了研究 HA基因疫苗,用PCR扩增H5亚型AIV HA基因,将其克隆到质粒pcDNA4/HisMax和pRc/CMV上得到真核表达质粒pC4H5和pCMVH5.采用Tfx^TM-20、Superfect转染试剂和电转染法转染HeLa细胞,转染后的HeLa细胞经蛋白质印迹和血凝试验检测HA蛋白及其活性.结果表明,Superfect转染和电转染均能正确表达HA蛋白并具有生物学活性,蛋白质印迹检测到HA和HA裂解的HA1和HA2,与AIV 的HA、HA1、HA2蛋白的分子质量一致.从血凝试验结果看,Superfect和电转染表达的HA均具有血凝活性,而经Superfect转染的pC4H5的表达量是pCMVH5的8倍,表明pC4H5是一高效的真核表达质粒.     

外源表达的人copine V诱导细胞死亡的研究

目的：copines蛋白家族是新近发现的一类分布广泛、进化保守的Ca2＋依赖性磷脂结合蛋白,copineV是其成员之一.为研究copineV基因的功能,构建了人copineV基因的真核表达质粒并转染HEK293细胞,以进一步研究其功能.方法：构建人copineV编码区序列的真核表达质粒pCDNA4/copineV,脂质体法转染HEK293细胞.通过RT-PCR、克隆形成实验和Hochesst33342染色等方法观察copineV基因对HEK293细胞生长的影响.结果：外源表达的人copine V可以诱导HEK293细胞死亡,无法筛选到稳定克隆.结论：人copineV可以诱导HEK293细胞死亡,为进一步研究copineV基因的生物功能提供了线索.     

核输入蛋白α/β真核表达载体的构建及细胞内定位

目的:构建带有myc标签的核输入蛋白(importin)α/β的真核表达载体,转染人胚肾293T细胞并分析其表达。方法:以乳腺癌文库为模板PCR扩增核输入蛋白α/β基因,扩增产物插入真核表达载体p XJ-40-myc,经双酶切和测序鉴定;将空载体与重组质粒分别转染人胚肾293T细胞,通过Western印迹和免疫荧光技术检测核输入蛋白α/β的表达。结果:酶切鉴定与测序结果表明构建的myc-Importinα/β真核表达载体正确;Western印迹检测到重组质粒在293T细胞中的表达;免疫荧光检测到核输入蛋白α定位于细胞质和细胞核,而核输入蛋白β定位于细胞核。结论:构建了核输入蛋白α/β的真核表达载体,并确定了其在细胞中的表达定位。     

DH结构域缺失对SGEF在293T细胞中定位的影响

目的:通过构建带EGFP标签的SGEF基因DH结构域缺失的真核表达载体pEGFP-C1-SGEF-△DH并使其在293T细胞表达,观察DH结构域缺失后SGEF在293T细胞中的定位。方法:利用重叠PCR技术在pcDNA3.1-SGEF质粒上扩增缺失DH结构域的SGEF基因,然后将PCR产物亚克隆到真核表达载体pEGFP-C1上,对阳性克隆进行双酶切和测序鉴定,利用脂质体转染方法转染293T细胞,并用Western印迹和细胞免疫荧光技术对重组质粒pEGFP-C1-SGEF-△DH在293T细胞中的表达及其蛋白定位进行分析。结果:双酶切和测序鉴定表明,pEGFP-C1-SGEF-△DH真核表达质粒构建成功,转染实验发现该质粒能够在293T细胞中表达,表达产物主要定位在细胞核内。结论:构建了带EGFP标签的人SGEF基因DH结构域缺失的真核表达载体,该载体能够在哺乳动物细胞293T中表达,表达产物定位于细胞核,为进一步研究SGEF基因DH结构域的细胞生物学功能提供了一个重要的工具。     

H1亚型猪流感病毒HA基因DNA疫苗的构建及其对Balb/c小鼠的免疫效果评价

以A/Swine/Guangdong/LM/2004(H1N1)猪流感病毒HA基因为模板,通过RT-PCR技术扩增出HA基因,并将其克隆到pCI-neo真核表达载体中,成功构建重组表达质粒pCI-HA,瞬时转染vero E6和293T细胞,通过免疫过氧化物酶单层细胞试验(Immunoperoxidase monolayer assay ,IPMA)、间接免疫荧光试验(indirect immunofluorescence assay, iIFA)和蛋白免疫印迹（Western blot,WB）实验证明,HA基因能够在哺乳动物细胞中有效表达并具有良好的生物学活性。将重组质粒三次免疫8w雌性Balb/c小鼠后,ELISA试验和中和试验结果表明该重组质粒能够诱导小鼠产生较高的抗体滴度,并具有良好的中和活性。因此为H1亚型猪流感DNA疫苗的研究奠定了理论基础。     

甲型H5N1流感病毒M2与HA双基因载体疫苗在小鼠体内的免疫学评价

高致病性H5N1亚型禽流感病毒 (AIV) 严重威胁到人类健康,因此研制高效、安全的禽流感疫苗具有重要意义。以我国分离的首株人H5N1亚型禽流感病毒 (A/Anhui/1/2005) 作为研究对象,PCR扩增基质蛋白2 (M2) 和血凝素 (HA) 基因全长开放阅读框片段,构建共表达H5N1亚型AIV膜蛋白基因 M2和HA的重组质粒pStar-M2/HA。此外,还通过同源重组以293细胞包装出表达M2基因的重组腺病毒Ad-M2以及表达HA基因的重组腺病毒Ad-HA。用间接免疫荧光 (IFA) 方法检测到了各载体上插入基因的表达。按初免-加强程序分别用重组质粒pStar-M2/HA和重组腺病毒Ad-HA+Ad-M2免疫BALB/c小鼠,共免疫4次,每次间隔14 d。第1、3次用DNA疫苗,第2、4次用重组腺病毒载体疫苗,每次免疫前及末次免疫后14 d采集血清用于检测体液免疫应答,末次免疫后14 d采集脾淋巴细胞用于检测细胞免疫应答。血凝抑制 (HI) 实验检测到免疫后小鼠血清中的HI活性。ELISA实验检测到免疫后小鼠血清中抗H5N1亚型流感病毒表面蛋白的IgG抗体。ELISPOT实验检测到免疫后小鼠针对M2蛋白和HA蛋白的特异性细胞免疫应答。流感病毒M2与HA双基因共免疫的研究,为研究开发新型重组流感疫苗奠定了基础。     

由乙肝病毒核心蛋白(HBc-VLP)递载的流感通用疫苗Flu@uV设计构建、表征及初步活性研究

目的:构建以HBc为载体的甲型流感病毒HA和M2e流感通用疫苗(Flu@uV),利用大肠杆菌BL21(DE3)表达系统,进行初步的蛋白表达及纯化。在此基础上,构建DNA流感通用疫苗。方法:利用全基因合成的序列为模板,成功构建HA-M2e-HBc、M2e-HBc、HBc、3M2e-HBc和3HA-3M2e-HBc基因的重组质粒,并在大肠杆菌中表达,经SDS-PAGE、Western blot和电镜检测其表达。将纯化的蛋白与弗氏佐剂共同免疫小鼠,取小鼠外周血进行流式细胞分析。通过荧光分析和Western blot初步验证DNA流感通用疫苗在人源胚胎肾细胞(HEK293T)中的表达情况。结果:成功表达纯化了HA-M2e-HBc、M2e-HBc、HBc和3M2e-HBc四种蛋白,经电镜观察到30nm左右的蛋白纳米颗粒样结构。小鼠外周血流式细胞分析显示HBc和3M2e-HBc可以增加小鼠的免疫力,而HA-M2e-HBc和M2e-HBc对小鼠免疫力的提高没有影响。通过荧光检测和Western blot检测说明DNA流感通用疫苗在真核细胞中成功表达。结论:成功构建HBc与甲型流感病毒HA和M2e的病毒样颗粒,为流感通用疫苗的研制奠定了重要基础。     

一种基于塞姆利基森林病毒复制子的新型复制子载体

RNA复制子是能自主复制的病毒RNA。基于RNA复制子的表达载体和基因疫苗比常规真核表达载体和DNA疫苗具有更大的优越性。以塞姆利基森林病毒RNA复制子衍生的真核表达载体pSFV1为骨架 ,插入CMV立即早期启动子和SV40晚期Poly(A)信号 ,构建了一种完全基于DNA的复制型表达载体pSFV1CS ,将增强型绿色荧光蛋白基因EGFP插入其中 ,构建了重组质粒pSFV1CS EGFP ,通过转染 2 93T细胞 ,证实外源基因能在其中高效表达。该载体可用于表达真核蛋白和构建复制子载体疫苗。     

Sublingual administration of bacteria-expressed influenza virus hemagglutinin 1 (HA1) induces protection against infection with 2009 pandemic H1N1 influenza virus

Influenza viruses are respiratory pathogens that continue to pose a significantly high risk of morbidity and mortality of humans worldwide. Vaccination is one of the most effective strategies for minimizing damages by influenza outbreaks. In addition, rapid development and production of efficient vaccine with convenient administration is required in case of influenza pandemic. In this study, we generated recombinant influenza virus hemagglutinin protein 1 (sHA1) of 2009 pandemic influenza virus as a vaccine candidate using a well-established bacterial expression system and administered it into mice via sublingual (s.l.) route. We found that s.l. immunization with the recombinant sHA1 plus cholera toxin (CT) induced mucosal antibodies as well as systemic antibodies including neutralizing Abs and provided complete protection against infection with pandemic influenza virus A/CA/04/09 (H1N1) in mice. Indeed, the protection efficacy was comparable with that induced by intramuscular (i.m.) immunization route utilized as general administration route of influenza vaccine. These results suggest that s.l. vaccination with the recombinant non-glycosylated HA1 protein offers an alternative strategy to control influenza outbreaks including pandemics.     

信号肽序列对禽流感病毒H5N1 HA 蛋白GFP融合分子在真核细胞中表达的影响

[目的]构建绿色荧光蛋白(GFP)与禽流感病毒(AIV)HA基因的融合表达载体,观察信号肽序列的有无及位置对HA-GFP在293T细胞中的表达影响.[方法]应用PCR方法从H5N1亚型AIV质粒DNA中扩增出完整的或除去信号肽序列的HA基因片段,PCR产物经Xho Ⅰ和SmaⅠ双酶切后定向插入绿色荧光蛋白真核表达载体pEGFP-C1的不同位点,将得到的重组体M1,M2和M3分别转化宿主菌DH5a,经双酶切及.DNA测序鉴定分析后,采用脂质体转染法将pEGFF-C1,M1,M2和M3转染人胚肾细胞系293T细胞,荧光显微镜下观察HA-GFP的表达,流式细胞仪检测表达HA蛋白的细胞百分数.[结果]经酶切及测序鉴定成功构建了HA-GFP重组表达载体M1,M2和M3,荧光显微镜及流式细胞仪检测到重组质粒转染的293T细胞表达强的荧光蛋白,信号肽的有无对HA-GFP融合蛋白在293T细胞中的表达有显著影响,信号肽序列使HA-GFP融合蛋白在293T细胞中的表达减少,而信号肽的位置对融合蛋白表达量的影响不显著.[结论]信号肽的有无对HA-GFP融合蛋白在细胞中的表达有显著影响.     

Baculovirus Displaying Hemagglutinin Elicits Broad Cross-Protection against Influenza in Mice

The widespread influenza virus infection further emphasizes the need for novel vaccine strategies that effectively reduce the impact of epidemic as well as pandemic influenza. Conventional influenza vaccines generally induce virus neutralizing antibody responses which are specific for a few antigenically related strains within the same subtype. However, antibodies directed against the conserved stalk domain of HA could neutralize multiple subtypes of influenza virus and thus provide broad-spectrum protection. In this study, we designed and constructed a recombinant baculovirus-based vaccine, rBac-HA virus, that expresses full-length HA of pandemic H1N1 influenza virus (A/California/04/09) on the viral envelope. We demonstrated that repeated intranasal immunizations with rBac-HA virus induced HA stalk-specific antibody responses and protective immunity against homologous as well as heterosubtypic virus challenge. The adoptive transfer experiment shows that the cross-protection is conferred by the immune sera which contain HA stalk-specific antibodies. These results warrant further development of rBac-HA virus as a broad-protective vaccine against influenza. The vaccine induced protection against infection with the same subtype as well as different subtype, promising a potential universal vaccine for broad protection against different subtypes to control influenza outbreaks including pandemic.     

可调控表达甲型流感病毒M2蛋白的哺乳动物细胞系的建立与鉴定

甲型流感病毒M2蛋白是一种具有离子通道功能的跨膜蛋白,其氨基酸序列非常保守,可用于流感通用疫苗的研究。为了构建可调控的稳定表达甲型流感病毒M2蛋白的哺乳动物细胞系,首先应用PCR方法从含有流感病毒PR8株第七节段全长基因的质粒中扩增得到M2基因。将该片段亚克隆到真核表达载体pcDNA5/FRT/TO上,用BamHⅠ和NotⅠ双酶切鉴定正确后将重组质粒与表达Flp重组酶的pOG44质粒共转染Flp-In T-REx-293细胞,使目的基因整合到宿主细胞染色体。筛选具有Hygromycin B抗性的细胞株。在该细胞的培养基中加入四环素以诱导目的基因表达,48 h后通过间接免疫荧光方法检测到M2蛋白的表达。共得到16株高表达M2蛋白的重组细胞株,这些细胞株在传10代后仍能稳定表达目的蛋白。未加四环素诱导的细胞没有检测到M2蛋白,说明四环素调控系统严格控制着目的基因的表达。今后,该细胞系可用于流感病毒M2蛋白的功能研究、流感候选疫苗的免疫学评价以及流感病毒减毒活疫苗的研制。     

表达流行性感冒病毒HA基因非复制型重组腺病毒的构建及免疫效果的研究

通过RT-PCR扩增流行性感冒(流感)病毒HA基因,克隆至腺病毒穿梭载体pAd Track-MV,该重组质粒与腺病毒DNA共转化E．coli BJ5183,通过细菌内同源重组获得重组腺病毒DNA,将其转染293细胞获得重组腺病毒。PCR证实HA基因已整合至腺病毒基因组中,Western blot结果检测到重组病毒感染293细胞中HA的表达。重组病毒经滴鼻和灌胃两种途径免疫小鼠,结果2次免疫后滴鼻组和灌胃组均产生明显的免疫应答,血清IgG抗体滴度分别为1：10000和1：1000。除血清IgG外,还在肺灌洗液中检测到分泌型IgA。滴鼻组的免疫效果强于灌胃组。经小剂量攻毒实验显示,重组腺病毒保护率为100％。该文成功构建了表达流感病毒HA基因的非复制型重组腺病毒,重组病毒免疫小鼠可产生较好的免疫效果。