抗人B7-H1单克隆抗体的制备和鉴定

目的:采用杂交瘤技术制备抗人B7-H1单克隆抗体,并对其进行鉴定。方法:经抗原免疫的小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞以常规方法融合;用间接ELISA法筛选分泌抗体的杂交瘤细胞株;阳性克隆用有限稀释法获得稳定分泌抗人B7-H1单克隆抗体的杂交瘤细胞株;扩增杂交瘤细胞注射进小鼠腹腔后制备腹水;纯化腹水中的单克隆抗体并对其亚型进行鉴定;用间接ELISA法测抗体效价;将肺癌组织制成石蜡切片,用抗人B7-H1抗体进行免疫组化染色。结果:获得1株稳定分泌抗人B7-H1单克隆抗体的杂交瘤细胞株,所分泌的单抗类型为IgG1;抗体效价为1×108,纯化后的抗体含量为6.76g/L;免疫组化实验中,单抗可与肺癌组织表面的B7-H1蛋白特异地结合。结论:制备了人B7-H1单克隆抗体,为B7-H1检测试剂盒的研制奠定了基础。     

人突触小体相关蛋白25单克隆抗体的制备及初步鉴定

目的:制备抗人突触小体相关蛋白25(SNAP25)的鼠源单克隆抗体。方法:利用大肠杆菌表达SNAP25蛋白,纯化后免疫BALB/c小鼠制备杂交瘤细胞,筛选针对SNAP25的阳性杂交瘤细胞株,鉴定抗体亚型;用杂交瘤细胞株制备腹水单抗,纯化后利用SDS-PAGE检测抗体纯度。结果:表达并纯化得到纯度大于90%的SNAP25蛋白,免疫小鼠后经2轮筛选得到12株阳性杂交瘤细胞株,其中抗体重链包括IgG1、IgG2型,轻链大部分为κ链;选择具有相对较高抗原结合活性的14号杂交瘤细胞株制备腹水,纯化后得到纯度大于90%的抗体。结论:获得1株高纯度的针对SNAP25的鼠源单克隆抗体,为肉毒毒素的检测奠定了基础。     

NT-proBNP特异性单克隆抗体的制备及鉴定

旨在制备并鉴定抗人NT-pro BNP特异性单克隆抗体。采用重组NT-pro BNP蛋白免疫Balb/c小鼠,取血清效价高的脾细胞与SP2/0细胞融合,经HAT筛选和有限稀释法亚克隆,获得阳性杂交瘤细胞株,用动物体内诱生法制备腹水,用正辛酸-硫酸铵沉淀法将抗体纯化,并测定抗体的亚类、效价、特异性及相对亲和力。结果表明,获得4株能稳定分泌抗人NT-pro BNP单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞株,分别命名为1G12、1B2、3D5和2D11。抗体Ig亚类,1G12和1B2为Ig G2a型,2D11为Ig G1型,3D5为Ig G2b型;1G12,1B2和3D5的抗体效价达到106,而2D11的效价仅达104。特异性好,1G12、1B2、3D5和2D11四株抗体的亲和常数依次为9.32×1011、1.07×1012、2.31×1012和6.33×1010。成功制备了特异性抗人NT-pro BNP单克隆抗体。     

人β-actin蛋白原核表达及其单克隆抗体制备

为获得分泌抗人β-actin蛋白单克隆抗体（McAb）的杂交瘤细胞,通过在大肠杆菌中原核表达人β-actin蛋白,以纯化的人β-actin蛋白作为抗原免疫BALB/c小鼠。经过细胞的融合及筛选获得1株能稳定分泌抗人β-actin蛋白McAb的杂交瘤细胞,命名为2B4。采用间接ELISA和Western blot方法对McAb的特异性、稳定性和适用范围进行鉴定。结果显示：蛋白的相对分子质量为43 kDa,可溶于8 mol/L尿素;杂交瘤细胞上清的抗体效价为1×10^5,腹水的抗体效价为1×10^7;间接ELISA结果表明,杂交瘤细胞在体外传20代或液氮冻存3个月后,分泌的抗体效价不变;37℃保存24 h后,抗体的效价开始下降。Western blot结果显示,单克隆抗体识别人、鼠、兔和鱼的β-actin蛋白,与其发生特异性反应。2B4分泌的单克隆抗体可以广泛的应用于细胞生物学和免疫学试验,具有良好的应用价值。     

抗新型隐球菌荚膜相关蛋白CAP10单克隆抗体的制备及鉴定

目的:以新型隐球菌荚膜相关蛋白CAP10为靶抗原,制备并鉴定特异性抗CAP10的单克隆抗体。方法:用纯化的重组CAP10免疫BALB/c小鼠,血清抗体效价达到适当水平时进行细胞融合;经多次亚克隆筛选出分泌特异性抗体的细胞株,制备单抗腹水并进行抗体效价测定及亚类鉴定。结果:获得11株能稳定分泌抗新型隐球菌荚膜相关蛋白CAP10的单克隆抗体杂交瘤细胞株,抗体效价高且抗原特异性强。结论:获得了针对新型隐球菌荚膜相关蛋白CAP10的单克隆抗体,为深入研究CAP10蛋白的功能,以及临床新型隐球菌的检测和血清型分析奠定了基础。     

Tropic1808基因重组蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

目的：制备Tropic1808基因重组蛋白的单克隆抗体,并对其生物学特性进行鉴定。方法：用Tropic1808基因重组蛋白作为抗原免疫BALB/C小鼠,取小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤（SP2/0）细胞融合,经ELISA筛选和有限稀释法获得分泌单克隆抗体的细胞株,Western Blot等方法对其生物学特性进行鉴定。结果：获得2株识别Tropic1808基因重组蛋白的单克隆抗体的细胞株Ⅱ4B、Ⅲ4C。WesternBlot法显示该抗体特异性地识别Tropic1808基因重组蛋白;ELISA法测定杂交瘤细胞培养上清及体内成瘤后产生的腹水的抗体效价分别为1：80、1：600;杂交瘤细胞染色体数平均为90-100;亚类鉴定单抗的重链为小鼠IgG1,轻链为κ型。结论：成功地制备了Tropic1808基因重组蛋白的单克隆抗体,为进一步研究Tropic1808基因重组蛋白的功能提供了良好的基础。     

抗胆汁螺杆菌单克隆抗体的制备

目的制备抗胆汁螺杆菌单克隆抗体（McAbs）。方法用胆汁螺杆菌B2m株皮下免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术进行融合。以酶联免疫吸附实验（ELISA）筛选抗胆汁螺杆菌单克隆杂交瘤细胞株并初步鉴定其特异性;免疫印迹试验测定单抗所结合的抗原表位;免疫双向扩散试验确定IgG亚类;腹腔接种法、辛酸-硫酸铵盐析法大量制备、纯化单克隆抗体。结果经过ELISA筛选获得11个阳性杂交瘤细胞株,其效价最高达1：4×10^5以上,并与实验动物常见的15种病原菌呈阴性反应;IgG亚类为IgG2a和IgG2b;免疫印迹试验显示,6株（A-F）与胆汁螺杆菌大约相对分子质量（172、0、21、30、52、66）×10^3的抗原特异结合,5株（G-K）皆与胆汁螺杆菌、幽门螺杆菌等三种螺杆菌大约相对分子质量（52、82）×10^3的抗原呈阳性反应,表明A-F株针对的是胆汁螺杆菌特异性抗原,G-K株可能具有属特异性。结论筛选的单克隆抗体具有较高的特异性和敏感性,所结合的抗原为胆汁螺杆菌或螺杆菌的免疫优势抗原,为进一步的种、属生物学特性研究、菌株分型及血清学检测方法建立等奠定了基础。     

Y盒结合蛋白1单克隆抗体的研制、表位测定及其免疫学应用

建立稳定分泌抗人Y盒结合蛋白1单克隆抗体(anti-YB-1 mAb)的杂交瘤细胞株,鉴定其表位与免疫学应用。将重组YB-1蛋白免疫BALB/c小鼠,取脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞融合。经ELISA法筛选鉴定、定株后采用腹水诱生法制备anti-YB-1 mAb;Protein G亲和层析法纯化mAb,ELISA法测定mAb效价、亚型及相对亲和力。采用抗原表位预测法鉴定anti-YB-1 mAb识别表位所在区域。Western blot和免疫组化鉴定mAb识别内源性YB-1的特异性。经筛选鉴定获得2株稳定分泌anti-YB-1 mAb的杂交瘤细胞(1-D9,3-E8);腹水抗体效价均≥1×10-6,亚型均为IgGl;1-D9和3-E8单抗识别表位分别位于(134-160aa)与(266-303aa)肽段。Western blot、免疫组化结果证实anti-YB-1 mAb能特异性识别内源性YB-1。该研究为YB-1免疫学定性、定量检测方法的建立、肿瘤靶向抗体治疗及进一步探讨YB-1的生物学功能奠定了基础。     

活化相关分泌蛋白1单克隆抗体的制备及其在保守结构域鉴定中的应用

目的:制备重组活化相关分泌蛋白1(ASP-1)的单克隆抗体,并用其鉴定保守结构域。方法:用原核表达并纯化的重组ASP-1不加佐剂免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术及有限稀释传代法筛选稳定分泌特异性抗体的杂交瘤细胞株,制备单抗腹水后用间接ELISA进行抗体特异性鉴定和效价检测,利用肽结合ELISA和Western印迹鉴定单抗识别的保守结构域。结果:获得5株能稳定分泌抗ASP-1单克隆抗体的杂交瘤细胞株,且5株单抗的识别区域均为21~28氨基酸残基的保守性结构域。结论:制备了抗ASP-1的单克隆抗体,为深入研究ASP-1佐剂的活性功能区及作用机制提供了有效工具。     

EpCAM蛋白的表达、纯化及其单克隆抗体的制备

目的:原核表达EpCAM蛋白并制备抗EpCAM特异性单克隆抗体,初步鉴定相应单克隆抗体的特性。方法:PCR扩增EpCAM基因胞外区,将目的基因亚克隆至载体pET-28a(+),转化至大肠埃希菌株BL21,IPTG诱导表达,组氨酸亲和层析法纯化表达产物。纯化蛋白免疫BALB/c小鼠,将成功免疫的小鼠脾细胞与骨髓瘤SP2/0细胞融合,经ELISA筛选得到分泌特异性抗EpCAM的单克隆抗体的细胞株,免疫BALB/c小鼠进一步制备相应的单克隆抗体,并通过Western blot(蛋白质印记)和FACS(流式细胞分析)鉴定单抗的特异性及生物学活性。结果:成功构建重组表达载体pET28a-EpCAM并在大肠杆菌中获得表达,经His-tag亲和层析法获得纯化的EpCAM重组蛋白。EpCAM重组蛋白免疫的BALB/c小鼠的脾细胞与SP2/0细胞融合、筛选,获得两株稳定分泌EpCAM抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为4B2、2F2并免疫BALB/c小鼠获得相应的单克隆抗体。Western blot结果显示4B2腹水纯化所得单抗能够识别FaDu细胞系(人咽鳞癌细胞)中的EpCAM蛋白,但2F2未能识别FaDu细胞中的变性的EpCAM蛋白。FACS结果显示两者均能和FaDu细胞中天然的EpCAM蛋白结合。讨论:成功制备了抗EpCAM的单克隆抗体,并能够识别人咽鳞癌细胞系FaDu中表达的EpCAM,为进一步研究EpCAM抗体在肿瘤治疗中的作用提供基础。     

单核增生李斯特菌Internalin A的克隆表达与抗体制备

目的克隆表达单核增生李斯特菌Internalin A（InlA）,并以之为抗原制备检测单核增生李斯特菌的抗体。方法通过PCR技术从单核细胞增生李斯特菌4b中扩增出inlA基因,克隆筛选和测序鉴定后,最终构建该基因的原核表达质粒pGEX-4T-InlA,谷胱甘肽树脂亲和层析纯化表达产物后,免疫小鼠分别制备相应的多抗和单抗。结果在大肠埃希菌中成功表达了InlA,并对其进行了纯化,融合表达产物分子量约为110 kD;免疫小鼠获得的抗血清效价达到1∶1600;得到了3株抗InlA的单克隆抗体杂交瘤细胞株,腹水单抗效价为1∶1×10^5-1∶3×10^5。2种抗体与其他病原菌均无交叉反应。结论通过表达单核增生李斯特菌的特异性蛋白制备的抗体,能有效地消除交叉反应,提高检测的特异性。     

抗重组人表皮生长因子单克隆抗体的制备及生物学特性鉴定

建立能稳定分泌特异性抗重组人表皮生长因子(rhEGF)单克隆抗体的杂交瘤细胞株 ,制备出高效价的 ,具有生物学活性的抗重组人表皮生长因子单克隆抗体 ,为EGF及其单克隆抗体在肿瘤生长调节中的作用研究 ,为肿瘤的诊断与治疗提供具有实用价值的研究工具。此外 ,为EGF的亲和层析纯化提供材料。以BALB/c小鼠脾细胞为饲养细胞 ,运用细胞杂交瘤技术制备 ,间接ELISA法筛选出能稳定分泌针对人表皮生长因子的单克隆抗体细胞株 ;对杂交瘤细胞进行染色体核型分析并以体内诱生法产生腹水以获得大量单克隆抗体 ,并采用HiTrapProteinAHP柱对其纯化…     

P2X7受体短肽单克隆抗体的制备及鉴定

旨在制备与鉴定鼠抗P2X7受体的蛋白单克隆抗体.以人P2X7受体的胞外段制备短肽作为抗原,皮下注射免疫Balb/c小鼠.分离小鼠脾脏B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合并培养,挑选阳性杂交瘤细胞,扩大培养,制备和鉴定P2X7其生物学效应.结果显示,获得1株稳定分泌抗人P2X7受体的单克隆抗体的杂交瘤细胞株,所分泌的单抗类型重链为IgG1,轻链为κ;该株杂交瘤细胞腹水效价为1∶6.4×104;传30代及液氮中保存6个月,抗体效价稳定;Western blotting检测证明该单抗与人细胞表面的P2X7受体蛋白特异地结合.所制备的抗人P2X7受体的单克隆抗体具有高度的特异性及稳定性,为针对P2X7受体为靶点的抗体药物的开发应用、疾病的辅助诊断奠定了基础.     

牛血清白蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立及鉴定

用牛血清白蛋白(BSA)免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,培养上清经过双抗体夹心法检测初步筛选分泌鼠IgG的杂交瘤细胞,将此种杂交瘤细胞注射小鼠产生的腹水用间接ELISA法筛选,获得4株能稳定分泌抗BSA单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为2A5、3A3、3G6、4A8。鉴定结果显示,2A5细胞分泌IgG2a/κ,其余3株细胞分泌IgG1/κ;纯化后4株腹水单抗的纯度达90%以上,对BSA的ELISA滴度均可达到1∶100000以上;4株单抗均不与人以及马、猪、羊、兔、豚鼠等血清发生交叉反应;W estern B lotting试验证明4株单抗均识别分子量为68000的BSA;用间接ELISA法测定4株单抗相对亲和力及相对敏感度大小依次为3A3>2A5>3G6>4A8;杂交瘤细胞株连续培养3个月以及冻存半年后复苏,细胞生长良好,杂交瘤细胞分泌的抗体效价稳定。     

幽门螺杆菌尿素酶B单克隆抗体的制备与鉴定

目的:制备稳定分泌抗幽门螺杆菌尿素酶B单克隆抗体(mAb)的杂交瘤细胞系,并对其分泌的mAb进行鉴定。方法:用初步纯化的重组幽门螺杆菌尿素酶B免疫BALB/c小鼠,利用杂交瘤技术制备抗尿素酶B的mAb,用间接ELISA检测mAb的特异性和亲和力,检测mAb腹水效价,鉴定Ig亚类并测定其抗原决定簇。结果:获得8株能稳定分泌抗尿素酶B的mAb杂交瘤细胞系,这8株单抗与能产生尿素酶的小肠结肠耶尔森氏菌、肺炎克雷伯氏菌和普通变形杆菌均无交叉反应,相对亲和力为1.13×10-8～4.66×10-10,腹水mAb效价可达2×104～3.2×105。其中2株单抗属IgG1亚类,3株单抗属IgG2a亚类。8株单抗分属于3种不同的抗原决定簇。结论:获得了IgG1和IgG2a类型的针对3种不同抗原决定簇的特异性幽门螺杆菌尿素酶B的mAb,为进一步用于幽门螺杆菌的临床诊断和实验研究创造了条件。     

牛呼吸道合胞体病毒核蛋白的表达及其单克隆抗体的制备

利用牛呼吸道合胞体病毒(BRSV)接种牛肺细胞(BL),提取病毒RNA。通过RT-PCR扩增BRSV的核蛋白基因,然后定向克隆到原核表达载体pET30a,获得重组表达质粒pET30a-N。将重组质粒转化表达菌BL21(DE3),经增菌培养和IPTG诱导以及SDS-PAGE和Western blot分析,成功表达出了核蛋白(N),其分子量约为49kDa。为制备BRSV核蛋白的单克隆抗体,用纯化的重组核蛋白免疫BALB/c小鼠,取免疫鼠脾细胞与SP2/0细胞融合。采用以BRSV为检测抗原的间接ELISA筛选阳性细胞克隆,经3次克隆纯化后获得2株稳定分泌抗N特异性MAb的杂交瘤细胞株,分别命名为2D12与4B10。用2D12与4B10杂交瘤细胞株接种BALB/c小鼠制备腹水,采用rN及BRSV包被的ELISA测得的效价分别是1×105和1×106及1×102和1×103。间接ELISA、Western blot、IFA试验表明两株杂交瘤细胞所分泌的MAb具有良好的反应性和特异性。经抗体亚类鉴定D12与4B10均为IgG1/κ。特异性试验表明单抗2D12与4B10均不与牛副流感病毒3型和牛病毒性腹泻病毒反应。所制备的D12与4B10可用于建立检测BRSV病原及抗体的诊断方法。     

抗羊口疮病毒ORFV118蛋白单克隆抗体的制备、鉴定及其应用

制备抗羊口疮病毒118(ORFV118)重组蛋白的单克隆抗体并鉴定其生物学特性。构建ORFV118原核表达重组质粒pET33b-ORFV118,将重组质粒转化大肠杆菌BL21,诱导表达出ORFV118重组蛋白;利用Ni-NTA亲和层析法纯化ORFV118重组蛋白;以纯化蛋白为抗原免疫小鼠,通过杂交瘤技术制备单克隆抗体;利用间接ELISA法、Western blot、免疫组化等方法分别对单抗特异性、效价、亚型以及ORFV118蛋白的功能进行研究。获得了3株稳定分泌单克隆抗体的细胞株,分别命名为1A2,3B5,5D10,它们诱生的小鼠腹水效价分别为110 000,16 400,18 000。其中效价最高的1A2抗体亚型为IgG1,能特异性结合其免疫原蛋白、真核表达产物以及病羊皮肤组织中的ORFV118蛋白。免疫组化结果显示单抗1A2染色局限于皮肤表皮层角化细胞及浸润至皮下组织的炎症细胞,与病毒侵染上皮组织层的特性相符。制备的单抗1A2能特异性识别ORFV118。深入研究单抗1A2将为了解ORFV118的生物学特性,为羊传染性脓疱病的诊断、预防与治疗提供可能和新思路。     

猪脑心肌炎病毒非结构蛋白3AB的原核表达及其单克隆抗体的研制

摘要　目的　利用原核表达系统表达猪脑心肌炎病毒 (EMCV) 非结构蛋白3AB,并通过杂交瘤细胞技术制备其单克隆抗体,为相关研究工作奠定基础。方法　利用大肠杆菌系统表达具有良好抗原性的重组3AB蛋白,经包涵体纯化后免疫BALB/ c 小鼠, 取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合, 间接ELISA筛选阳性的杂交瘤细胞, 并结合免疫荧光(IFA)和Weatern Blot对抗体的特异性进行鉴定。 结果　经间接ELISA 筛选阳性的杂交瘤细胞, 获得1株能稳定分泌抗3AB蛋白抗体的杂交瘤细胞株,将其命名为2D12,其亚类测定为IgG1 /κ。Western Blot和间接免疫荧光试验证明该单抗能特异性识别3AB蛋白。结论　成功获得了针对EMCV-3AB 的特异性单抗,为进一步研究猪脑心肌炎病毒非结构蛋白3AB的结构与功能及临床诊断试剂的研发奠定必要的物质基础。     

番茄环斑病毒单克隆抗体的制备

以纯化的番茄环斑病毒(Tomato ringspot virus,ToRSV)为抗原,注射免疫BALB/c小鼠,将免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞Sp2/0进行融合,经多次细胞筛选及克隆化,获得3株(A8、B7和G9)可分泌抗ToRSV单克隆抗体的杂交瘤细胞株,并以之分别制备小鼠腹水单克隆抗体。经酶联免疫吸附试验检测表明,该3株杂交瘤细胞腹水抗体效价在10-5～10-6之间,且均具有与ToRSV反应的特异性。     

抗人血栓调节蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

为了制备特异性抗人血栓调节蛋白(human thrombomodulin,hTM)的单克隆抗体(monoclonal antibody,McAb),利用脂质体Lipofectamine 2000将包含hTM全长cDNA序列的重组表达质粒pThr402转染CHO细胞,经G418筛选及相关鉴定后获得高效稳定表达hTM的CHO-TM5细胞株。将CHO-TM5细胞直接免疫Balb/c小鼠,应用杂交瘤技术,通过细胞ELISA (cellular enzyme-linked immunoabsorbent assay,CELISA)筛选出阳性克隆后,将杂交瘤细胞株腹腔注射Balb/c小鼠诱生腹水。用CELISA、流式细胞术、免疫组织化学染色法及免疫印迹法对所获McAb的特异性进行鉴定。我们获得了1株可稳定分泌抗hTM的McAb的杂交瘤细胞株NH-1,其亚型为IgGl,McAb腹水效价为1×10~(-6),腹水抗体含量为20 mg/ml。NH-1对相应抗原具有较高的组织特异性,在体内与正常组织的交叉反应少,对人脐静脉内皮细胞、CHO-TM5有特异性结合反应,说明NH-1可特异性识别天然的hTM分子,为进一步应用此McAb进行hTM生物学功能及临床意义研究提供了基础。