基于亚细胞定位的大豆和鹰嘴豆原生质体分离体系的建立与优化

以湘豆3号大豆和Kabuli型鹰嘴豆幼嫩叶片为材料,研究了酶解种类及配比、酶解液中甘露醇浓度、酶解液p H和酶解时间对两种豆科植物幼嫩叶片原生质体产量和存活率的影响。结果表明,湘豆3号大豆叶片在含有0.5%纤维素酶Onozuka R-10、0.8%半纤维素酶Hemicellulase、0.8%离析酶Macerozyme R-10、0.4%果胶酶Pectolyase Y-23、0.1%2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES)和10%甘露醇的酶解液中(pH 6.0),27℃黑暗条件下恒温水浴振荡(45 r/min)酶解6 h,分离得到的原生质体产量和存活率最高;Kabuli型鹰嘴豆叶片在含有0.5%纤维素酶Onozuka R-10、0.8%半纤维素酶Hemicellulase、0.8%离析酶Macerozyme R-10、0.1%MES和10%甘露醇酶解液中(pH 4.8),27℃黑暗条件下恒温振荡水浴(45 r/min)7–8 h,分离得到的原生质体产量和存活率最高。通过上述件分离到的湘豆3号大豆和Kabuli型鹰嘴豆幼嫩叶片原生质体用于亚细胞定位的效果最好。     

白及原生质体的分离与纯化

为建立起白及原生质体分离纯化的技术体系,以白及组培苗叶片为材料,经不同方式预处理后,用不同浓度的纤维素酶、果胶酶、离析酶和甘露醇组合进行酶解,将释放出来的原生质体用过滤和离心的方法进行纯化,最后用荧光素双醋酸酯(FDA)法对纯化的原生质体进行活力率测定,以期系统建立起酶解法从叶片中分离纯化出白及原生质体的技术流程。结果发现在低温黑暗+0.75 mol·L~(~(-1))甘露醇条件下对叶片进行预处理、酶液组合为1.5%纤维素酶Cellulase R~(-1)0+0.4%果胶酶Pectolyase Y-23+0.5%离析酶Macerozyme R~(-1)0+0.75 mol·L~(~(-1))甘露醇、酶解液p H值保持在5.8、摇床转速120 r·min~(~(-1))、酶解4 h时,得到的原生质体产量最大,达4.72×10~6个·g~(~(-1)),活力率也达90.4%。本研究构建了用白及叶片分离和纯化原生质体的技术流程,为白及遗传资源的拓展和遗传改良奠定了一定的物质和技术基础。     

北美鹅掌楸原生质体的分离与培养

以鹅掌楸属植物北美鹅掌楸的悬浮细胞和组培苗叶片为材料,对北美鹅掌楸原生质体分离、纯化与培养条件进行研究.结果表明:叶片和悬浮细胞用含有0.1％2-吗啉乙磺酸(MES)和0.6 mol/L甘露醇的Cell ProtoplastWash(60M-CPW)溶液25℃预处理lh效果最好;悬浮细胞最佳酶解液为60M-CPW+ 1％纤维素酶+1％半纤维素酶+0.2％果胶酶Y-23+0.1％ MES,每克材料25℃酶解6h有效原生质体产量可以达到3×106个;叶片最佳酶解液为60M-CPW+2％纤维素酶+1％半纤维素酶+0.2％果胶酶Y-23+0.1％ MES,每克材料25℃酶解10 h有效原生质体产量可以达到11×106个;悬浮细胞原生质体易于培养,在KM8p+1.0 mg/L 2,4-D+0.5 mg/L 6-BA培养基中培养25 d可形成肉眼可见的愈伤组织.     

茶树叶肉原生质体的分离与纯化

以茶树幼苗叶片为材料,分析了甘露醇浓度、不同酶液组合、酶解时间等因素对叶肉原生质体分离及2种高密度分离液对原生质体纯化的影响。结果表明,叶片在含0.6 mol/L的甘露醇、1.5%的纤维素酶和2.5%的离析酶的酶解液中黑暗酶解16~18 h,叶肉原生质体的分离效果最好。此外,研究发现原生质体在10%的甘露醇与25%的碘克沙醇界面处聚集形成了一条带。     

‘陇东’紫花苜蓿原生质体最佳分离条件

以‘陇东’紫花苜蓿（Medicago sativa L.cv.‘Longdong’）下胚轴愈伤组织为材料,研究酶液组合、酶解时间、酶液渗透压、愈伤组织继代培养时间及预处理措施对原生质体分离效果的影响。结果表明：获得产量最高（8.8×105个·g-1）、活力最高（88.55%）的原生质体最佳酶液组合为2%纤维素酶＋0.5%果胶酶＋0.3%崩溃酶、酶解时间为10h、酶液渗透压即甘露醇浓度为0.55mol·L-1,愈伤继代培养天数为12d、预处理措施为4℃、黑暗条件下放置24h。     

葡萄原生质体分离及瞬时转化体系的建立

为了建立葡萄原生质体进行遗传转化的技术,该研究以葡萄品种‘黑香蕉’的叶片和愈伤组织为材料,分析纤维素酶和离析酶的浓度与配比、渗透压和酶解时间等主要因素对葡萄原生质体分离的影响,探讨建立稳定、高效的葡萄原生质体分离与瞬时转化体系,为鉴定目标基因的功能奠定基础。结果表明:(1)葡萄叶片原生质体的分离以3.0%纤维素酶和0.75%离析酶的酶组合,在0.6mol/L甘露醇溶液中,酶解14h为宜,每克游离产量为4.09×106个原生质体,活力为83.12%。(2)葡萄愈伤组织原生质体的分离以2.0%纤维素酶和0.5%离析酶的酶组合,在0.5mol/L甘露醇溶液中,酶解14h为宜,每克游离产量为6.05×106个原生质体,活力为84.13%。(3)利用该方法得到的葡萄原生质体为受体,采用40%PEG-4000介导转化质粒载体pEZS-NL,目标基因瞬时表达产物检测表明,GFP蛋白表达稳定、清晰。该研究建立的葡萄原生质体制备和转化体系,可以用较少量的质粒DNA获得外源基因在原生质体内的表达,为葡萄功能基因的研究提供技术支持。     

狗头枣叶片原生质体分离研究

以培养25d的狗头枣试管苗叶片为材料,研究了不同酶液浓度,不同甘露醇浓度对狗头枣组培苗叶片原生质体分离的影响.结果表明适合狗头枣组培苗叶片原生质体分离的适宜酶液配比为1.0 g/L纤维素酶、0.4 g/L果胶酶,0.6 mol/L甘露醇,黑暗条件下,酶解8h,可获得大量有活力的原生质体.其叶片原生质体的产量为2.12×106个/g,活原生质体获得率为80.88％.     

‘石牌’广藿香叶肉原生质体的分离及纯化

以‘石牌’广藿香无菌苗叶片为材料,对原生质体分离、纯化方法以及影响因素进行了研究。结果表明:以继代培养12～22 d的无菌苗顶芽下第3对展开叶片为材料,用0.5%果胶酶、0.2%离析酶和1.5%纤维素酶作用8 h,渗透压调节剂为11%甘露醇,‘石牌’广藿香叶肉原生质体产量达1.85×107个/g fw,活力达89%;原生质体纯化以12%聚蔗糖(Ficoll)漂浮法效果最佳。     

'过山香'香蕉胚性悬浮细胞原生质体分离的方法研究

目的:研究不同的方法对‘过山香'胚性悬浮细胞原生质体分离的影响,筛选最适合用于‘过山香'香蕉胚性悬浮细胞原生质体分离的方案.方法:用不同浓度、不同组合的酶液对‘过山香'原生质体进行分离,并对酶液的甘露醇含量、pH值进行调节.结果:3.0%纤维素酶R-10+0.2%果胶酶Y-23的是最佳酶组合;酶解8 h、酶液中含0.41 M甘露醇、酶液pH值为5.3时,获得原生质体产量最高.结论:合适的酶组合、酶解时间、酶液的渗透压和pH值对‘过山香'香蕉胚性悬浮细胞原生质体的分离有明显的促进作用.     

杂花和紫花苜蓿原生质体分离培养条件的筛选

以杂花苜蓿‘甘农1号’和紫花苜蓿‘甘农4号’、‘阿尔冈金’及‘清水’4个适宜西北内陆黄土高原地区栽培的苜蓿愈伤组织为材料,研究酶解时间、酶液组合、酶液渗透压、愈伤组织继代培养时间、预处理措施及不同培养方法等对原生质体分离和培养效果的影响,并对培养条件进行优化。结果表明:(1)适宜4个苜蓿品种愈伤组织酶解的最佳预处理措施为0.55mol/L蔗糖或CPW溶液中预质壁分离1h,最佳继代时间均为12d。(2)‘甘农1号’、‘甘农4号’和‘清水’的最佳酶液组合均为2%纤维素酶+0.5%果胶酶+0.3%崩溃酶;‘阿尔冈金’的最佳酶液组合为2%纤维素酶+0.5%果胶酶+0.3%半纤维素酶+0.3%离析酶+0.3%崩溃酶;‘甘农1号’和‘阿尔冈金’的最佳酶解时间为12h,‘甘农4号’和‘清水’分别为14h和10h。(3)适宜4个品种酶解的甘露醇浓度分别为‘甘农1号’0.75mol/L,‘甘农4号’0.65mol/L,‘阿尔冈金’0.6mol/L,‘清水’0.55~0.6mol/L。(4)经液体浅层培养和固液培养方式均可获得4个苜蓿品种的再生愈伤组织,且固液培养法较液体浅层培养法更有利于苜蓿原生质体早期的培养和再生。     

雷公藤悬浮细胞原生质体的制备及瞬时转化体系的建立

为探索药用植物雷公藤(Tripterygium wilfordii)悬浮细胞原生质体提取的最优条件,并建立雷公藤原生质体瞬时转化体系,以雷公藤悬浮细胞为材料,对酶解液配比、酶解时间、甘露醇浓度及处理转速进行考察。用PEG介导的瞬时转化法将外源基因转化到雷公藤原生质体中。结果表明,以雷公藤悬浮细胞为材料提取原生质体的最佳条件是酶液配比为2.0%纤维素酶+0.5%果胶酶+0.5%离析酶,甘露醇浓度为0.6 mol·L–1,酶解10小时,处理转速为67×g;用PEG介导法将含有编码GFP的植物表达载体转化雷公藤悬浮细胞原生质体,激光共聚焦扫描显微镜下细胞显示绿色荧光。通过实验筛选得到雷公藤悬浮细胞原生质体的最佳提取条件,建立了雷公藤悬浮细胞原生质体的瞬时转化体系,为进一步开展雷公藤功能基因及合成生物学研究奠定了基础。     

甘蓝型油菜与蔊菜的原生质体融合与植株再生

以甘蓝型油菜下胚轴和蔊菜叶片为外植体提取原生质体, 采用PEG-高pH、高Ca²⁺附加DMSO的原生质体融合方法, 用液体浅层静置培养融合体, 获得了10株融合杂种, 观察了杂种形态学和细胞学。结果表明：1%纤维素酶+0.2%离析酶+3 mmol/L MES 酶解14 h 可获得较高产率的油菜原生质体, 0.25% 纤维素酶+0.5%离析酶+5 mmol/L MES酶解12 h可获得较高产率的蔊菜原生质体; 30% PEG + 0.3 mol/L葡萄糖+50 mmol/L CaCl₂•2H₂O +15%DMSO的融合条件下, 获得了10.4%的融合率; 实验所获的原生质体融合材料可作为新种质。     

沙冬青子叶原生质体瞬时表达体系的建立及其AmDREB1蛋白的亚细胞定位

以沙冬青(Ammopiptanthus mongolicus(Maxim.ex Kom.)Cheng f.)幼苗的子叶为材料,对其原生质体的分离、纯化和瞬时表达体系进行了研究。结果表明,子叶原生质体分离的最佳酶解液组成为CPW溶液+3.0%纤维素酶R-10+0.5%离析酶R-10+0.3%半纤维素酶+9.0%甘露醇(p H5.8);最佳酶解条件为室温、避光、40 r/min轻摇14 h。采用W5溶液作为漂洗液将酶解物稀释后进行过滤,将过滤液在4℃、700 r/min条件下离心5 min,所得纯化原生质体的产量约为2.50×106cells/g,活力达到90%;以纯化的原生质体作为受体,利用聚乙二醇(PEG)介导法成功将植物瞬时表达载体p BI-GFP导入其中,转化效率达到50.8%。利用本研究建立的原生质体瞬时表达体系,检测到沙冬青脱水应答转录因子Am DREB1定位于细胞核内。     

灵芝原生质体分离与再生研究*

首次详细、系统地探讨了灵芝原生质体分离与再生的条件,结果表明：用0．6mol／L甘露醇配制成含2％溶壁酶和0．5％崩溃酶的复合酶,在30℃,pH为6.0时酶解3小时,可得到最高的原生质体得率。但考虑到原生质体的再生,以酶解2．5小时为最适。酶解2．5小时所得原生质体经精制,用纤维二糖培养基（以0.6mol／L甘露醇为渗透压稳定剂）进行双层平板（上层平板含0．2％琼脂）培养法再生,原生质体的再生率最高。本研究为以后进行灵芝原生质体的融合以及灵芝的转基因研究打下了基础。     

虎仗原生质体分离纯化及电融合初步研究

以野生虎杖根状茎芽为外植体诱导虎杖愈伤组织,选取生长状况良好的愈伤组织作为原生质体分离材料,通过L16(44)正交试验对虎杖原生质体分离条件进行优化.结果表明:1.4%纤维素酶R-10,0.1%果胶酶,17%甘露醇的酶液,酶解时间7h,虎杖原生质体分离效果最好.在80r/min振荡分离后虎杖原生质体得率为46.2%.以800r/min的离心速度纯化,纯化的原生质体得率为43.8%,其中原生质体的成活率为75%.通过对虎杖原生质体进行融合,原生质体的融合率为20.2%.     

Plant Regeneration from Protoplasts of Coriandrum sativum

Calli produced from stem segments of seedling of Coriandrum satwum which were cultured on MS agar medium containing NAA 1.0mg/L. The embryogenic cell colony suspension was estabilished on MS liquid medium containing NAA 1.0mg/L%2,4-D 0.2mg/L+BA 0.5 mg/L. The cell suspension culture was used for protoplast preparation. Protoplasts were obtained in the enzyme mixture containing 2.0% Onozuka R-10, 1.0% pectinase, 0.5% snailase, 0.5% dextran sulfate potassium Salt, 0.6mol/L mannital CPW solution at pH 5.8 and 25℃. Cultured in a KM8P liquid medium containing NAA 1.0mg/L+2,4-D 0.2mg/L+6-BA 0.5 mg/L, glucose 0.4mol/L and CM 20mi/L; the protoplasts entered the stage of derision after three days, cell clusters formed in 10 days and calli formed after about 50 days. When the calli were transferred to MS agar medium containing many growth substances, they differentiated into embryoids, and then developed into plantlet with many green leaves and roots on the 1/2 MS agar medium.     

利用荧光染色和流式细胞技术辅助卵孢小奥德蘑原生质体制备与再生研究

本研究以卵孢小奥德蘑液体培养菌丝作为实验材料,利用单因子变量法探索研究了菌丝培养时间、酶浓度、酶解时间、酶解温度、稳渗剂类型对卵孢小奥德蘑原生质体制备的影响,并对原生质体再生培养基进行选择和优化。通过荧光染色,利用激光共聚焦显微镜和流式细胞仪对原生质体的制备过程、得率和活力进行研究。结果表明,将卵孢小奥德蘑菌丝在液体培养基中培养5d收集菌丝体,以甘露醇作为渗透压稳定剂,在溶壁酶浓度2%、30℃条件下酶解5h,获得的原生质体得率最高,达2.0×10 ⁷个/mL;通过流式细胞仪分析,约57.69%的原生质体细胞为活细胞;在RM培养基中再生效果最好,再生率为(0.103±0.025)%。研究结果可以为卵孢小奥德蘑育种与食用菌原生质体制备再生提供研究基础。     

蛹虫草原生质体紫外诱变选育胞外多糖高产菌株

蛹虫草是重要的药食兼用两用真菌,具有较高的医用及经济价值。本文通过单因素和正交试验的方法研究了不同酶系统、酶解温度、酶解时间、渗透压稳定剂、菌龄对蛹虫草原生质体形成的影响,并对蛹虫草原生质体进行紫外诱变,以生物量和胞外多糖产量为指标选育胞外多糖高产菌株。结果表明：在30℃、1％溶壁酶＋0．5％蜗牛酶＋0．5％纤维素酶条件下,以甘露醇为渗透压稳定剂对4日龄蛹虫草菌丝酶解2h,原生质体产量可达到9．2×10^6个/mL。从150株诱变株中筛选出1株最佳正诱变株,编号为44#,经深层培养其生物量比出发菌株提高10％,胞外多糖产量提高84．3％,继代培养10代后,遗传稳定性良好。     

基于响应面法对香菇原生质体制备条件的优化

香菇Lentinula edodes是我国食用菌年产量最大的单品,优化香菇原生质体的制备条件,获得高质量、高活力的原生质体可以为香菇育种和遗传多样性分析提供技术保障。本研究利用单因素试验对稳渗剂浓度、酶解液类型、酶解时间、酶解温度4个因素的最优作用条件和相关性进行检验和筛选;依据单因素试验的结果,对酶解时间、酶解温度、酶解液种类进行响应面法3因素3水平试验优化分析。单因素试验结果表明,使用2%的溶壁酶+蜗牛酶+纤维素酶混合酶制剂为酶解液、0.6 mol/L甘露醇为稳渗剂的效果显著高于其他处理(P<0.05)。经Box-Behnken设计得出香菇原生质体最佳制备条件为酶解时间3.25 h,酶解液浓度1.7%,酶解温度30.49 ℃,获得原生质体产量为14.02×10⁶ CFU/mL,与理论产量(13.862×10⁶ CFU/mL)偏差小,可为后续原生质体融合育种和多样性分析提供重要基础。