沙冬青AmNAC3转录因子基因在抗旱性和抗寒性中的功能鉴定

为了研究强抗逆植物沙冬青Am NAC3转录因子基因在抗旱性和抗寒性中的功能,首先利用半定量RT-PCR方法对该基因进行了表达分析。结果表明,在室内培养的沙冬青幼苗中,Am NAC3有一定量的基础表达,在干旱胁迫下其转录水平明显上调,而在低温胁迫下其表达上调较弱。然后利用5'RACE技术获得该基因的5'端序列及全长cDNA序列,并利用RT-PCR方法克隆到其全长编码区(846bp)。将编码区片段构建到植物表达载体上,利用农杆菌介导法获得转基因拟南芥。进一步分析表明,转基因拟南芥对于干旱和低温胁迫的抗性表型与野生型无明显差异,但其离体叶片的失水率和气孔开度均大于野生型。此外,转基因幼苗中气孔开闭相关基因ABI1和ABI2的表达量降低。这些结果表明,Am NAC3可能主要在响应干旱胁迫和调节气孔开闭及叶片保水性中发挥功能,而在抵抗低温胁迫中无明显作用。     

沙冬青AmCaM1基因的克隆及其功能初步分析

钙调素(calmodulins, CaMs)是一类非常保守的Ca2+感受蛋白,在Ca2+信号转导中起重要调节作用。本研究分析了强抗逆植物沙冬青(Ammopiptanthus mongolicus)AmCaM1在非生物胁迫下的表达变化,克隆了该基因并将其构建到植物表达载体上,然后转化拟南芥进行了初步的功能分析。结果表明,AmCaM1的转录水平在低温、干旱和盐胁迫下迅速上调;其cDNA编码区由450 bp组成,编码蛋白含149个氨基酸残基,在其一级结构中具有四个保守的EF-手型基序;将该基因转化拟南芥可提高种子萌发期对水分胁迫的耐性,而对耐盐和耐冷性无明显作用。     

沙冬青AmNAC6基因的克隆与功能初步分析

以强抗逆植物沙冬青(Ammopiptanthus mongolicus(Maxim. ex Kom.) Cheng f.)为材料,克隆获得一个NAC转录因子基因Am NAC6的全长cDNA,并对其序列特征、蛋白质亚细胞定位和表达模式进行了分析。研究结果表明,Am NAC6基因的编码蛋白由304个氨基酸组成,具有NAC家族典型的结构特征,亚细胞定位实验证实该蛋白分布于细胞核内。表达图谱分析结果显示,在室内培养的沙冬青幼苗中,Am NAC6的转录水平受干旱、高盐、低温和高温胁迫的影响,其中在干旱诱导下该基因的转录水平上调较为明显;野外生长植株的嫩叶中,该基因的转录水平在中秋和初冬略低于其他季节,春季则低于其在侧根、嫩枝、花蕾和未成熟果荚中的转录水平。此外,本研究还将Am NAC6基因成功地构建到植物表达载体。     

沙冬青子叶原生质体瞬时表达体系的建立及其AmDREB1蛋白的亚细胞定位

以沙冬青(Ammopiptanthus mongolicus(Maxim.ex Kom.)Cheng f.)幼苗的子叶为材料,对其原生质体的分离、纯化和瞬时表达体系进行了研究。结果表明,子叶原生质体分离的最佳酶解液组成为CPW溶液+3.0%纤维素酶R-10+0.5%离析酶R-10+0.3%半纤维素酶+9.0%甘露醇(p H5.8);最佳酶解条件为室温、避光、40 r/min轻摇14 h。采用W5溶液作为漂洗液将酶解物稀释后进行过滤,将过滤液在4℃、700 r/min条件下离心5 min,所得纯化原生质体的产量约为2.50×106cells/g,活力达到90%;以纯化的原生质体作为受体,利用聚乙二醇(PEG)介导法成功将植物瞬时表达载体p BI-GFP导入其中,转化效率达到50.8%。利用本研究建立的原生质体瞬时表达体系,检测到沙冬青脱水应答转录因子Am DREB1定位于细胞核内。     

一种马铃薯高效无标记转基因技术的建立

用农杆菌介导法转化马铃薯栽培品种紫花白的叶盘,通过1/4 MS培养基预培养、热激处理、低pH、高糖培养基共培养,之后利用PCR直接检测转化体,结果表明遗传转化效率可达5.1%,建立了马铃薯无标记转基因技术.该技术受基因型的限制小,用于其它3个不同的栽培品种东北白、晋薯7号和早大白,遗传转化效率亦达到了4.1%~8.3%.利用这项无标记转基因技术,在载体构建时就剔除了标记基因,遗传转化后直接分化培养,不必对转化细胞进行抗性筛选,缩短了遗传转化周期,省去了费时费力的标记基因剔除步骤,亦为重复转化聚合多个优良基因提供了便利.     

蒙古沙冬青冷冻胁迫SMART cDNA文库的构建及序列分析

以强抗逆植物蒙古沙冬青 (Ammopiptanthus mongolicus)为材料,用SMART技术构建了其在冷冻胁迫下的全长cDNA文库。原始文库滴度为9.44?06 pfu.mL-1,重组率为98.3%,插入片段长度在0.5~2.5kb,平均达到1kb。扩增文库滴度为1.98?010pfu.mL-1。从原始文库中随机挑取480个阳性克隆进行序列分析,获得348个Unigene,其中有些是逆境应答相关基因和新基因。此外,以扩增文库为模板,经PCR方法克隆到读码框为1083bp的沙冬青类RD22基因。这些结果表明所建文库质量较高,可以满足后续研究的要求。     

沙冬青细胞与分子生物学研究进展

沙冬青是我国西北荒漠区唯一的常绿阔叶灌木,具有极强的抗逆性和特殊的医疗保健作用。本文从细胞学与遗传多样性、抗逆性分子基础与基因克隆和药用成分及作用机制方面对沙冬青的研究进展进行了综述,并提出了今后的重点研究方向。     

异源表达蒙古沙冬青AmDREB1F基因提高转基因拟南芥的耐逆性

脱水应答元件结合蛋白 (Dehydration-responsive element binding proteins,DREBs) 是一类重要的植物耐逆相关转录因子。蒙古沙冬青Ammopiptanthus mongolicus是中国西北荒漠区特有的强耐逆常绿阔叶灌木。为探明其AmDREB1F基因在耐受非生物逆境中的功能和作用机理,文中对该基因编码蛋白的亚细胞定位、表达模式和转基因拟南芥的耐逆性进行了分析。结果表明：AmDREB1F编码的蛋白质定位于细胞核内;在室内培养幼苗中,该基因在正常条件下不表达,在低温和干旱胁迫下有较明显表达,在高盐和高温胁迫下仅有微弱表达,而在脱落酸 (Abscisic acid,ABA) 处理下不表达;在野外生长植株的叶片中,其表达量在秋末、冬季和早春远高于其他季节,而不同器官相比,其在根和未成熟果荚中的表达量远高于其他器官;将AmDREB1F在拟南芥中组成型表达可提高多个受DREBs调控的胁迫响应基因的转录水平,增强转基因株系对干旱、高盐和低温以及氧化胁迫的耐性,同时导致其生长发育延滞,外施赤霉素3可消除生长延滞现象;将该基因进行胁迫诱导表达也可提高转基因拟南芥对上述非生物胁迫的耐受性,而不影响其生长发育。这些结果说明AmDREB1F可能通过ABA非依赖的信号途径在响应和耐受逆境胁迫中起正调节作用。     

蒙古沙冬青AmRD22基因的克隆及耐逆功能研究

脱水应答蛋白22(RD22)属于植物特有的BURP蛋白家族中的一个亚族,与耐逆性关系密切。该研究从中国西北荒漠区特有的强耐逆植物蒙古沙冬青克隆到一个RD22基因(AmRD22)的全长cDNA,并对其编码蛋白、表达模式和耐逆功能进行了研究。结果表明：(1)AmRD22蛋白(360 aa)的初级结构中含有RD22亚族共有的4个结构域,预测其定位于细胞壁;在功能已知的RD22蛋白中,AmRD22与大豆GmRD22的进化关系最近。(2)在室内培养的蒙古沙冬青幼苗中,AmRD22的表达受失水、高盐、低温和ABA胁迫的诱导显著上调,其中失水和低温胁迫诱导其上调幅度较大;在野外生长的蒙古沙冬青植株嫩叶中,其表达量从中秋至隆冬远高于其他季节。(3)转AmRD22基因拟南芥的耐盐性显著提高且Na⁺含量降低,其耐旱性也有较明显的改善且在种子萌发早期对外源ABA的敏感性降低,但耐冷性和耐冻性无明显变化。