沙冬青AmNAC3转录因子基因在抗旱性和抗寒性中的功能鉴定

为了研究强抗逆植物沙冬青Am NAC3转录因子基因在抗旱性和抗寒性中的功能,首先利用半定量RT-PCR方法对该基因进行了表达分析。结果表明,在室内培养的沙冬青幼苗中,Am NAC3有一定量的基础表达,在干旱胁迫下其转录水平明显上调,而在低温胁迫下其表达上调较弱。然后利用5'RACE技术获得该基因的5'端序列及全长cDNA序列,并利用RT-PCR方法克隆到其全长编码区(846bp)。将编码区片段构建到植物表达载体上,利用农杆菌介导法获得转基因拟南芥。进一步分析表明,转基因拟南芥对于干旱和低温胁迫的抗性表型与野生型无明显差异,但其离体叶片的失水率和气孔开度均大于野生型。此外,转基因幼苗中气孔开闭相关基因ABI1和ABI2的表达量降低。这些结果表明,Am NAC3可能主要在响应干旱胁迫和调节气孔开闭及叶片保水性中发挥功能,而在抵抗低温胁迫中无明显作用。     

沙冬青AmNAC6基因的克隆与功能初步分析

以强抗逆植物沙冬青(Ammopiptanthus mongolicus(Maxim. ex Kom.) Cheng f.)为材料,克隆获得一个NAC转录因子基因Am NAC6的全长cDNA,并对其序列特征、蛋白质亚细胞定位和表达模式进行了分析。研究结果表明,Am NAC6基因的编码蛋白由304个氨基酸组成,具有NAC家族典型的结构特征,亚细胞定位实验证实该蛋白分布于细胞核内。表达图谱分析结果显示,在室内培养的沙冬青幼苗中,Am NAC6的转录水平受干旱、高盐、低温和高温胁迫的影响,其中在干旱诱导下该基因的转录水平上调较为明显;野外生长植株的嫩叶中,该基因的转录水平在中秋和初冬略低于其他季节,春季则低于其在侧根、嫩枝、花蕾和未成熟果荚中的转录水平。此外,本研究还将Am NAC6基因成功地构建到植物表达载体。     

沙冬青子叶原生质体瞬时表达体系的建立及其AmDREB1蛋白的亚细胞定位

以沙冬青(Ammopiptanthus mongolicus(Maxim.ex Kom.)Cheng f.)幼苗的子叶为材料,对其原生质体的分离、纯化和瞬时表达体系进行了研究。结果表明,子叶原生质体分离的最佳酶解液组成为CPW溶液+3.0%纤维素酶R-10+0.5%离析酶R-10+0.3%半纤维素酶+9.0%甘露醇(p H5.8);最佳酶解条件为室温、避光、40 r/min轻摇14 h。采用W5溶液作为漂洗液将酶解物稀释后进行过滤,将过滤液在4℃、700 r/min条件下离心5 min,所得纯化原生质体的产量约为2.50×106cells/g,活力达到90%;以纯化的原生质体作为受体,利用聚乙二醇(PEG)介导法成功将植物瞬时表达载体p BI-GFP导入其中,转化效率达到50.8%。利用本研究建立的原生质体瞬时表达体系,检测到沙冬青脱水应答转录因子Am DREB1定位于细胞核内。     

异源表达蒙古沙冬青AmDREB1F基因提高转基因拟南芥的耐逆性

脱水应答元件结合蛋白 (Dehydration-responsive element binding proteins,DREBs) 是一类重要的植物耐逆相关转录因子。蒙古沙冬青Ammopiptanthus mongolicus是中国西北荒漠区特有的强耐逆常绿阔叶灌木。为探明其AmDREB1F基因在耐受非生物逆境中的功能和作用机理,文中对该基因编码蛋白的亚细胞定位、表达模式和转基因拟南芥的耐逆性进行了分析。结果表明：AmDREB1F编码的蛋白质定位于细胞核内;在室内培养幼苗中,该基因在正常条件下不表达,在低温和干旱胁迫下有较明显表达,在高盐和高温胁迫下仅有微弱表达,而在脱落酸 (Abscisic acid,ABA) 处理下不表达;在野外生长植株的叶片中,其表达量在秋末、冬季和早春远高于其他季节,而不同器官相比,其在根和未成熟果荚中的表达量远高于其他器官;将AmDREB1F在拟南芥中组成型表达可提高多个受DREBs调控的胁迫响应基因的转录水平,增强转基因株系对干旱、高盐和低温以及氧化胁迫的耐性,同时导致其生长发育延滞,外施赤霉素3可消除生长延滞现象;将该基因进行胁迫诱导表达也可提高转基因拟南芥对上述非生物胁迫的耐受性,而不影响其生长发育。这些结果说明AmDREB1F可能通过ABA非依赖的信号途径在响应和耐受逆境胁迫中起正调节作用。     

沙冬青AmFAD2-1基因的克隆及其功能分析

细胞膜脂的不饱和度主要由脂肪酸去饱和酶(fatty acid desaturase,FAD)决定,二者与植物抵抗低温和高盐等逆境胁迫密切相关。沙冬青(Ammopiptanthus mongolicus)是中亚荒漠区唯一的常绿旱生阔叶植物,具有很强的耐寒、耐旱和耐盐碱等特性。该研究利用RT-PCR方法克隆到沙冬青油酸去饱和酶基因AmFAD2-1的cDNA和gDNA,其中后者不含内含子。在AmFAD2-1蛋白(含382个氨基酸残基)序列中含有FAD家族必须的保守组氨酸簇和内质网定位信号及跨膜结构域。进化分析表明,AmFAD2-1与大豆(Glycine max)和柠条锦鸡儿(Caragana korshinskii)等豆科植物的FAD2距离较近,而与玉米(Zea mays)和拟南芥(Arabidopsis thaliana)等其他植物的FAD2距离较远。qRT-PCR分析表明,在室内培养的沙冬青幼苗中,AmFAD2-1的表达量在低温处理2～24h和干旱处理6～13d期间显著上调,在盐胁迫处理期间则呈现升高、降低、再升高的变化趋势;在野外生长的沙冬青成株嫩叶中,其表达量在秋季和冬季总体上明显高于春季和夏季。成功构建了植物表达载体p3300-35S-AmFAD2-1并通过根癌农杆菌介导法转化野生型拟南芥,获得16株转AmFAD2-1基因植株。耐逆性鉴定表明,转基因株系的耐冻性较野生型拟南芥显著提高,其耐旱性和耐盐性也比后者有较明显的改善。