南蛇藤原生质体培养及植株再生

以4℃低温暗处理24 h的南蛇藤胚性愈伤组织为分离原生质体的原材料,用MS培养基进行液体浅层静置、固液双层以及琼脂糖包埋培养原生质体,获得再生愈伤组织并分化成苗,建立了原生质体培养体系。结果表明,低温暗处理利于高产率高质量原生质体的获得;0.5%纤维素酶+0.5%果胶酶+5 mmol.L-1MES为酶的最佳配方;12 h为最佳酶解时间;13%为甘露醇最佳浓度;静置12 h+振荡0.5 h为最佳酶解方式;液体浅层静置培养取得了较好的原生质体培养效果;MS+6-BA2.0 mg.L-1+IBA 0.1 mg.L-1为愈伤组织最佳分化培养基;1/2MS+NAA0.1 mg.L-1为最佳生根培养基。     

北美鹅掌楸原生质体的分离与培养

以鹅掌楸属植物北美鹅掌楸的悬浮细胞和组培苗叶片为材料,对北美鹅掌楸原生质体分离、纯化与培养条件进行研究.结果表明:叶片和悬浮细胞用含有0.1％2-吗啉乙磺酸(MES)和0.6 mol/L甘露醇的Cell ProtoplastWash(60M-CPW)溶液25℃预处理lh效果最好;悬浮细胞最佳酶解液为60M-CPW+ 1％纤维素酶+1％半纤维素酶+0.2％果胶酶Y-23+0.1％ MES,每克材料25℃酶解6h有效原生质体产量可以达到3×106个;叶片最佳酶解液为60M-CPW+2％纤维素酶+1％半纤维素酶+0.2％果胶酶Y-23+0.1％ MES,每克材料25℃酶解10 h有效原生质体产量可以达到11×106个;悬浮细胞原生质体易于培养,在KM8p+1.0 mg/L 2,4-D+0.5 mg/L 6-BA培养基中培养25 d可形成肉眼可见的愈伤组织.     

苦荞叶肉细胞原生质体的分离纯化及瞬时转化

高效分离原生质体是遗传转化、细胞融合和再生培养的基础性工作。该实验以苦荞(Fagopyrum tartaricum)品种‘榆6-21’的叶肉细胞为材料,研究了酶类组合、甘露醇浓度、酶解时间以及离心速度对苦荞叶肉细胞原生质体分离纯化的影响。结果表明:酶解液组成为1.5%纤维素酶R-10+0.5%离析酶R-10+0.5mol/L甘露醇+20mmol/L MES+20mmol/L KCl+10mmol/L CaCl2+0.1%牛血清白蛋白,以第5~7片真叶为材料,用胶带纸撕去叶片下表皮后,25℃黑暗酶解4h,以900r/min离心收集,可以获得高质量的原生质体,原生质体产量可达6×106个/g,活力达到90%以上;用双荧光素酶报告基因载体检测原生质体的转化效率,以分离纯化的苦荞叶肉细胞原生质体为受体,将双荧光素酶报告基因载体与其混合后,在终浓度为20%PEG4000介导下,黑暗转化20min,可以检测到较高活性的萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶,证明双荧光素酶报告载体可成功转化到原生质体中。研究结果为苦荞原生质体瞬时转化及遗传操作提供了技术基础。     

去壁酶与酶解方式对曲霉原生质体释放的影响

研究了纤维素酶、蜗牛酶、溶菌酶以及菌丝体培养方式和酶解方式对黑曲霉和米曲霉菌丝释放原生质体的效应。发现黑曲霉菌丝原生质体制备最佳条件为固体透析培养菌丝体,2%纤维素酶,在平皿中,28℃和80r/min条件下酶解3h;米曲霉原生质体制备最佳条件为2%纤维素酶+1%蜗牛酶+5mmol/L二硫苏糖醇,酶解时间6h,其它条件与黑曲霉的相同。     

菠菜原生质体游离与纯化的研究

以菠菜为实验材料进行原生质体分离、纯化、活力鉴定。结果表明:1.5%纤维素酶OnozukaR-10+1%果胶酶Pectolase+0.5mol/L甘露醇+CPW盐的酶液,酶解时间5h,菠菜原生质体的获得率高。纯化时,适当降低离心时间有利于原生质体纯化过程中产量及活力的保持,500r/min离心5min,效果较好。     

玉米、小麦、水稻原生质体制备条件优化

玉米Zea mays L.、小麦Triticum aestivum L.、水稻Oryza sativaL.是三大重要粮食作物,对其原生质体制备条件的优化具有重要意义.以玉米(综3)、小麦(中国春)、水稻(日本晴)10日龄幼苗为材料,研究了叶肉细胞原生质体分离过程中的酶浓度、酶解时间和离心力大小等因素对产量和活力的影响.结果表明:酶浓度和酶解时间对原生质体产量影响显著,随着酶解液浓度和酶解时间的提高,原生质体产量增加,但细胞碎片同时增多.水稻经真空处理后,原生质体产量大幅度提高.通过正交实验设计得出如下结果:玉米叶肉细胞原生质体分离的最佳条件为:纤维素酶1.5％,离析酶0.5％,50 r/min酶解7h,100×g离心2 min收集,原生质体产量为7×106/g FW;小麦叶肉细胞原生质体分离的最佳条件为:纤维素酶1.5％,离析酶0.5％,50 r/min酶解5h,100×g离心2 min收集,原生质体产量为6×106/g FW;水稻叶肉细胞原生质体分离的最佳条件为:纤维素酶2.0％,离析酶0.7％,50 r/min酶解7h,1 000×g离心2 min收集,得到的原生质体产量为6×106/g FW.通过二乙酸荧光素染色发现原生质体活力均在90％以上.用PEG-Ca2+介导法将含有绿色荧光蛋白的质粒转化入原生质体,转化率可达50％ ～80％.     

基于亚细胞定位的大豆和鹰嘴豆原生质体分离体系的建立与优化

以湘豆3号大豆和Kabuli型鹰嘴豆幼嫩叶片为材料,研究了酶解种类及配比、酶解液中甘露醇浓度、酶解液p H和酶解时间对两种豆科植物幼嫩叶片原生质体产量和存活率的影响。结果表明,湘豆3号大豆叶片在含有0.5%纤维素酶Onozuka R-10、0.8%半纤维素酶Hemicellulase、0.8%离析酶Macerozyme R-10、0.4%果胶酶Pectolyase Y-23、0.1%2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES)和10%甘露醇的酶解液中(pH 6.0),27℃黑暗条件下恒温水浴振荡(45 r/min)酶解6 h,分离得到的原生质体产量和存活率最高;Kabuli型鹰嘴豆叶片在含有0.5%纤维素酶Onozuka R-10、0.8%半纤维素酶Hemicellulase、0.8%离析酶Macerozyme R-10、0.1%MES和10%甘露醇酶解液中(pH 4.8),27℃黑暗条件下恒温振荡水浴(45 r/min)7–8 h,分离得到的原生质体产量和存活率最高。通过上述件分离到的湘豆3号大豆和Kabuli型鹰嘴豆幼嫩叶片原生质体用于亚细胞定位的效果最好。     

茶树叶肉原生质体的分离与纯化

以茶树幼苗叶片为材料,分析了甘露醇浓度、不同酶液组合、酶解时间等因素对叶肉原生质体分离及2种高密度分离液对原生质体纯化的影响。结果表明,叶片在含0.6 mol/L的甘露醇、1.5%的纤维素酶和2.5%的离析酶的酶解液中黑暗酶解16~18 h,叶肉原生质体的分离效果最好。此外,研究发现原生质体在10%的甘露醇与25%的碘克沙醇界面处聚集形成了一条带。     

大花蕙兰原生质体分离纯化

以大花蕙兰的叶片、根为试材,分析不同酶液组合、摇床转速、酶解温度、材料酶液比、酶解时间等因素对其原生质体分离的影响。大花蕙兰叶片、根经过90 min质壁分离预处理后,在温度28 ℃,于摇床上50 r·min^-1振荡酶解6 h,叶、根分别在酶解液为纤维素酶2.0%＋果胶酶0.1%＋离析酶0.2%＋崩溃酶0.2%和纤维素酶2.0%＋果胶酶0.3%＋离析酶0.1%＋崩溃酶0.1%中得到最高产量的原生质体。     

基于响应面法对香菇原生质体制备条件的优化

香菇Lentinula edodes是我国食用菌年产量最大的单品,优化香菇原生质体的制备条件,获得高质量、高活力的原生质体可以为香菇育种和遗传多样性分析提供技术保障。本研究利用单因素试验对稳渗剂浓度、酶解液类型、酶解时间、酶解温度4个因素的最优作用条件和相关性进行检验和筛选;依据单因素试验的结果,对酶解时间、酶解温度、酶解液种类进行响应面法3因素3水平试验优化分析。单因素试验结果表明,使用2%的溶壁酶+蜗牛酶+纤维素酶混合酶制剂为酶解液、0.6 mol/L甘露醇为稳渗剂的效果显著高于其他处理(P<0.05)。经Box-Behnken设计得出香菇原生质体最佳制备条件为酶解时间3.25 h,酶解液浓度1.7%,酶解温度30.49 ℃,获得原生质体产量为14.02×10⁶ CFU/mL,与理论产量(13.862×10⁶ CFU/mL)偏差小,可为后续原生质体融合育种和多样性分析提供重要基础。     

Regeneration of Hybrid Plantlets Via Pollen-Hypocotyl Protoplast Fusion in Brassica spp.

It has been reported that "gameto-somatic hybridization" was induced by fusion of microspore tetrad protoplasts with somatic protoplasts in Nicotiana and Petunia. However, since the success of isolation of pollen protoplasts in recent years, the use of protoplasts at pollen stage as one of the fusion partners in such hybridization is a novel experimentation. Young pollen protoplasts were isolated from the pollen grains of Brassica chinensis at mid-late unicellular to early bicellular stage the pollens for 1.5--2.5 h at 25℃ in a CPW solution containing 0.8 % of eellulase, 0.5 % pectinase, 0.1% pectolyase, 1 3 % mannitol, 1 0 % glucose, 0. 3% potassium dextran sulphate and 3 mmol/L MES. The purified pollen protoplasts were then fused with the hypocotyl protoplasts of B. napus by PEG method. Heterokaryons were identified by means of visualization of the fluorescence from FITC-prela-beled pollen protoplasts. In order to increase heterokaryons and reduce hypocotyls homokaryons, the denstity of hypocotyl protoplasts were lowered and the ratio of the number of hypocotyl vs. pollen protoplasts were adjusted from 1 : 3 to 1 : 6. The fusion products were cultured in a liquid KM8p medium supplemented with 0.4 mol/L glucose, 0.8 mg/L 2, 4-D, 0.25 mg/L NAA. 0. 5 mg/L BA, 500 mg/L glutamine and 3 mmol/L MES where cell division and callus formation took place. The calli, after being transferred to a MS medium supplemented with 2.0 mg/L BA, 3 % sucrose and 0.4 % agarose, differentiated into a few shoots. The shoots were transferred onto a half-strength MS medium supplemented with 2% sucrose, 0.1--0. 2 mg/L NAA, 0.5 mg/L IBA and 20% potato juice for root formation. Finally, three plantlets were regenerated. Chromosome counts by roottip squash method revealed that one plantlet was 2n= 48, corresponding to an allotriploid resulted from a fusion between one pollen protoplast of B. chinensis (2n = 20) and one hypocotyl protoplast of B. napus (2n = 38), and the other two plantlets were 2n = 58, which might be an allotetraploid originated from a fusion between two pollen protoplasts and one hypocotyl protoplast. The isozyme patterns of leaf esterases showed that all the three plantlets had bands characteristic of both parents. This is the first case of success in "gameto-somatic hybridization" by using pollen protoplasts rather than tetrad protoplasts as the haploid partner.     

石牌广藿香原生质体的分离及培养研究

以石牌广藿香悬浮细胞为材料,对影响其原生质体分离和培养的酶浓度、作用时间、溶液渗透压和材料的生理状态等因素进行了研究。结果表明:以0.5%的果胶酶、0.2%离析酶和0.8%的纤维素酶组合处理继代培养3～11d的悬浮细胞8h,渗透压调节剂为9%甘露醇,原生质体产量达1.65×106 protoplasts·mL-1 PCV,活力超过86%。在原生质体的液体浅层培养中,细胞分裂频率为13.5%。     

甘蓝型油菜与芝麻菜体的细胞杂交

为拓宽油菜育种的基因资源库, 改良油菜品种, 以甘蓝型油菜(Brassica napus)花油3号下胚轴和芝麻菜(Eruca sativa)下胚轴为材料分离制备原生质体; 然后采用PEG-高Ca2+-高pH法进行原生质体融合, 当PEG浓度为35%, 原生质体融合密度为5×105个/mL时, 融合25 min时, 融合率可达18.2%。融合后在培养密度为1×105个/mL时, 以附加1.0 mg/L 2,4-D +0.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+ 200 mg/L肌醇+300 mg/L水解酪蛋白的改良的KM8p为融合体培养基, 以0.1 mol/L 蔗糖+0.2 mol/L葡萄糖+0.2 mol/L甘露醇作渗透稳定剂进行液体浅层培养, 效果较好, 愈伤组织再生率最高为6.8%。将融合体再生的小愈伤组织转移至培养基(B5无机盐+0.087 mol/L蔗糖+0.2 mg/L 2, 4-D+0.5 mg/L NAA+0.2 mg/L 6-BA+ 0.5% Agar, pH 5.8)上增殖培养, 待愈伤组织长至直径为3~5 mm时, 及时将其转至分化培养基(MS无机盐+0.087 mol/L 蔗糖+0.1 mg/L IAA+0.8 mg/L 6-BA+0.8% Agar, pH 5.8)中诱导不定芽再生, 芽分化率为35.7%。当不定芽长为2~3 cm时, 将其切下转入附加0.5 mg/L IBA+0.2 mg/L 6-BA的1/2MS生根培养基中诱导生根, 14 d左右即可形成再生植株, 生根率可达88%。同时, 以紫外线(60 μW/cm2)照射芝麻菜原生质体, 进行不对称融合, 照射2 min的获得了愈伤组织和再生植株, 照射4 min的只获得愈伤组织, 而照射5 min以上的没有获得愈伤组织, 但其愈伤组织再生、增殖及植株再生均不如对称融合。从细胞学鉴定的21块杂种愈伤组织上再生出16株杂种植株。     

甘蓝型油菜与芝麻菜体的细胞杂交

为拓宽油菜育种的基因资源库, 改良油菜品种, 以甘蓝型油菜(Brassica napus)花油3号下胚轴和芝麻菜(Eruca sativa)下胚轴为材料分离制备原生质体; 然后采用PEG-高Ca2+-高pH法进行原生质体融合, 当PEG浓度为35%, 原生质体融合密度为5×105个/mL时, 融合25 min时, 融合率可达18.2%。融合后在培养密度为1×105个/mL时, 以附加1.0 mg/L 2,4-D +0.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+ 200 mg/L肌醇+300 mg/L水解酪蛋白的改良的KM8p为融合体培养基, 以0.1 mol/L 蔗糖+0.2 mol/L葡萄糖+0.2 mol/L甘露醇作渗透稳定剂进行液体浅层培养, 效果较好, 愈伤组织再生率最高为6.8%。将融合体再生的小愈伤组织转移至培养基(B5无机盐+0.087 mol/L蔗糖+0.2 mg/L 2, 4-D+0.5 mg/L NAA+0.2 mg/L 6-BA+ 0.5% Agar, pH 5.8)上增殖培养, 待愈伤组织长至直径为3~5 mm时, 及时将其转至分化培养基(MS无机盐+0.087 mol/L 蔗糖+0.1 mg/L IAA+0.8 mg/L 6-BA+0.8% Agar, pH 5.8)中诱导不定芽再生, 芽分化率为35.7%。当不定芽长为2~3 cm时, 将其切下转入附加0.5 mg/L IBA+0.2 mg/L 6-BA的1/2MS生根培养基中诱导生根, 14 d左右即可形成再生植株, 生根率可达88%。同时, 以紫外线(60 μW/cm2)照射芝麻菜原生质体, 进行不对称融合, 照射2 min的获得了愈伤组织和再生植株, 照射4 min的只获得愈伤组织, 而照射5 min以上的没有获得愈伤组织, 但其愈伤组织再生、增殖及植株再生均不如对称融合。从细胞学鉴定的21块杂种愈伤组织上再生出16株杂种植株。     

双亲灭活制备粘质沙雷氏菌和红曲霉的跨界产色素融合子

目的：采用双亲灭活原生质体技术制备粘质沙雷氏菌和红曲霉的跨界产色素融合子,并测定其抑菌活性。方法：经0.2%溶菌酶处理获得粘质沙雷氏菌的原生质体并热灭活;经混合酶（0.8%溶菌酶＋1.2%蜗牛酶＋1.6%纤维素酶）处理获得红曲霉的原生质体并紫外灭活;用含25%PEG的原生质体融合剂进行促融合与再生。观察融合子的菌落形态和色素合成能力,测定融合子色素提取物对金黄色葡萄球菌的抑制活性。结果：在优化条件下,粘质沙雷氏菌原生质体的形成率为92.58%,红曲霉原生质体形成数约为106个/mL,两菌原生质体灭活率均为100%。共获得13个融合子,9个能产红色素,融合率为1×10-5%。其中8个融合子的95%乙醇提取物对金黄色葡萄球菌表现出不同程度的抑制。结论：采用双亲灭活原生质体技术,能够制备具有抑菌活性的粘质沙雷氏菌和红曲霉的跨界产色素融合子。     

双亲灭活制备粘质沙雷氏菌和红曲霉的跨界产色素融合子

目的:采用双亲灭活原生质体技术制备粘质沙雷氏菌和红曲霉的跨界产色素融合子,并测定其抑菌活性。方法:经0.2%溶菌酶处理获得粘质沙雷氏菌的原生质体并热灭活;经混合酶(0.8%溶菌酶+1.2%蜗牛酶+1.6%纤维素酶)处理获得红曲霉的原生质体并紫外灭活;用含25%PEG的原生质体融合剂进行促融合与再生。观察融合子的菌落形态和色素合成能力,测定融合子色素提取物对金黄色葡萄球菌的抑制活性。结果:在优化条件下,粘质沙雷氏菌原生质体的形成率为92.58%,红曲霉原生质体形成数约为106个/mL,两菌原生质体灭活率均为100%。共获得13个融合子,9个能产红色素,融合率为1×10-5%。其中8个融合子的95%乙醇提取物对金黄色葡萄球菌表现出不同程度的抑制。结论:采用双亲灭活原生质体技术,能够制备具有抑菌活性的粘质沙雷氏菌和红曲霉的跨界产色素融合子。     

玉米核糖体失活蛋白基因z108在烟草原生质体中的转化及其表达

利用与根癌农杆菌共培养的方法将玉米核糖体失活蛋白基因z108及其融合基因GUS导入烟草叶肉原生质体细胞。试验结果表明,烟草叶片在含有1.0%纤维素酶和0.5%离析酶的裂解液中,以0.5M甘露醇、5000.0mg/LCaCl2为渗透压调节剂,25℃保温12-14h,可获得纯化的原生质体细胞;纯化的叶肉原生质体细胞与根癌农杆菌菌株pCam1301/91-108共培养30min,经25mg/L潮霉素筛选,转化率可达17.84%。转化体细胞经X-Gluc染色、PCR和RT-PCR检测证明玉米核糖体失活蛋白基因z108已整合到烟草原生质体细胞的核基因组中并获得表达。     

Factors influencing protoplast isolation from Coffea arabica cells

Cultured plant cells such as Coffea arabica L. cells, accumulate low concentration of secondary metabolites. One way to obtain high-producing plant cell cultures is to prepare single cell clones by using protoplast systems. Identification of limiting factors should facilitate the development of an isolation procedure that can generate adequate yields of intact and viable protoplasts Coffea arabica L. suspension cells. The most suitable conditions for protoplasting were as follows: 6 g of fresh tissue were plasmolysed in 100 ml of K ₃ salts (Nagy & Maliga 1976) containing 0.5 M sucrose for 1 h at 24°C. Then, 1 g of preplasmolysed cells were incubated in 10 ml of cellulase R10 (1%), macerozyme R10 (0.8%) and driselase (0.5%) in preplasmolysis medium. The protoplasts were collected and purified after 15 h of lytic reaction in the dark, at 28°C. More than 75% and 95% of the cells were converted into protoplasts when 5 and 8 day-old suspensions respectively were used for the release step. A number of viable protoplasts ranging from 3.5×10⁶ to 4.6×10⁶ P g^-1 fresh weight was obtained corresponding to an increase by a factor 10 to 15 of the protoplast yield obtained by Acuna & De Pena (1991).Abbreviations BAP 6-benzylamino purine - BSA Bovine Serum Albumin - 2,4-d 2,4-dichlorophenoxyacetic acid - FDA fluorescein diacetate - MES 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid - NAA naphthalene acetic acid - PI propidium iodide - PCV Packed Cell Volume - fw fresh weight     

非洲菊原生质体制备及瞬时转化系统的建立

非洲菊(Gerbera hybrida)已成为研究复杂花序进化与发育的模式植物。以非洲菊无菌组培苗叶片为材料,分析不同浓度纤维素酶及离析酶配比对非洲菊原生质体提取效率的影响,建立了稳定、高效的非洲菊原生质体提取与瞬时转化体系。结果表明,以2.0%纤维素酶+0.3%离析酶组合,在0.4 mol·L~(–1)甘露醇溶液中,酶解4小时,酶解温度为25°C,得到产量高达2.2×10~7个·g~(–1) FW及活力较高的原生质体,可直接用于植物蛋白亚细胞定位和蛋白间相互作用实验,转化效率达80%。该研究建立了非洲菊原生质体制备和瞬时转化体系,为非洲菊基因功能研究奠定重要的技术基础。