抗胃癌细胞系单克隆抗体PD4的初步研究

以胃癌细胞系MGC803免疫Balb/c小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞NS-1融合。经选择培养、筛选及克隆化,获得恒定地分泌抗胃癌细胞系单克隆抗体(MoAb)的杂交瘤细胞系PD4。MoAb PD4与3/4胃癌细胞系有强结合反应,与4/4肺癌细胞系有弱结合反应,但与淋巴细胞、ABO红细胞、骨髓细胞、二倍体成纤维细胞及经检测的其他肿瘤细胞均无反应。PD4抗原主要表达于靶细胞的膜上,不耐热,为分子量40kD的蛋白性抗原。该抗原与HLA抗原系统,血型抗原系统无关,亦不同于其他作者所报告的其他胃癌相关抗原。     

抗HSV-1淋巴细胞杂交瘤的建立及应用单克隆抗体对HSV分型

应用HSV-1 SM44株感染的BHK-21细胞及提取的感染细胞膜蛋白抗原免疫Balb/c小鼠。以免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞系Sp_2/0融合,经ELISA筛选仅与HSV-1反应的阳性克隆及克隆化,建立了一株产生抗HSV-1型特异性McAb的杂交瘤细胞系(Mad-2)。经ELISA,IF及抗原吸收试验证明,该细胞系的培养上清及制备的小鼠腹水均与HSV-1呈特异性反应,但不与HSV-2反应。ELISA测定McAb Mad-2的腹水效价为10~(-7)Ig亚类鉴定为IgG-1。应用Mad-2和抗HSV型共同性McAb 1A12及抗HSV-2型特异性McAb CH-A9,对43株临床HSV分离株做了ELISA及IF分型。结果表明,28株口唇、眼部感染分离株和1株宫颈炎分离株均与1A12和Mad-2反应,不与CH-A9反应,为HSV-1。余14株富颈炎分离株均与1A12和CH-A9反应,而不与Mad-2反应,为HSV-2。ELISA和IF分型的结果完全一致。本研究提出作者应用的一套抗HSVMcAb有可能作为HSV型别鉴定的标准试剂。     

马IgM、IgG单克隆抗体的研制与鉴定

以马IgM、luG作为免疫抗原,以此免疫BALB/c小鼠,并取其脾细胞与骨髓瘤细胞(SP2.0)融合,通过酶联免疫吸附试验(ELISA)方法筛选,结果获得了4株分泌抗马IgM和2株分泌抗IgG的单克隆抗体的杂交瘤细胞,特异性试验证明,4株IgM单抗有很好的特异性,仅与马的IgM特异反应,而不与IgG反应;这4株单抗分别命名为IgM4H、IgM6B、IgM8A和IgM12F.经鉴定,IgM4H、IgM6B、IgM12F株为IgG1亚类,IgM8A株为IgG2a亚类,杂交瘤细胞的平均染色体数目为99条.杂交瘤细胞培养上清液及小鼠腹水McAb的ELISA都具有较高的效价,该杂交瘤细胞连续培养20代后仍能稳定分泌抗体.2株IgG的单克隆抗体有很好的特异性,只与IgG反应,而不与IgM发生交叉反应.     

东北虎免疫球蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

【目的】提纯东北虎免疫球蛋白并制备其单克隆抗体(McAb),为东北虎传染性疾病诊断试剂盒研制、疫苗免疫效果评估及基础免疫学研究奠定基础。【方法】以饱和硫酸铵和重组的Protein G相结合,提纯东北虎免疫球蛋白作为抗原,免疫C57BL/6小鼠,和骨髓瘤细胞系Sp2/0-Ag14相融合制备杂交瘤细胞,ELISA和蛋白免疫印迹筛选及鉴定阳性克隆,应用杂交瘤产生的McAb鉴定提纯免疫球蛋白及制备的McAb免疫学活性,非竞争性ELISA法测定了其亲和常数。【结果】得到3株稳定分泌抗东北虎免疫球蛋白McAb的杂交瘤细胞,产生的抗体全部识别免疫球蛋白的重链,通过对猫泛白细胞减少症病毒株(FPV-HLJ)灭活疫苗免疫东北虎的抗体消长的检测,证明提纯的免疫球蛋白及其McAb的免疫活性。【结论】Protein G能够用于东北虎免疫球蛋白的提纯,ATD11杂交瘤产生的McAb与抗原有较强的结合能力和免疫学活性,为今后开展东北虎传染病的诊断方法及疫苗研究奠定基础。     

人心肌肌钙蛋白Ⅰ单克隆抗体及多克隆抗体的制备

目的:以重组人心肌肌钙蛋白Ⅰ(cTnⅠ)为抗原制备鼠源单克隆抗体(McAb)及兔源多克隆抗体,并鉴定抗体的特性。方法:以纯化的重组人cTnⅠ为抗原免疫BALB/c小鼠,取鼠脾细胞同Sp2/0骨髓瘤细胞融合,利用选择培养基筛选融合的杂交瘤细胞,用有限稀释法分离获得能够稳定分泌抗cTnⅠ的McAb阳性克隆,并利用体内诱生法大规模制备McAb,用辛酸-硫酸铵沉淀法纯化抗体;兔多抗制备以cTnⅠ为抗原常规免疫后取其血清;用间接ELISA和Western印迹鉴定抗体的性质。结果:经ELISA鉴定,筛选出5株能分泌cTnⅠMcAb的杂交瘤细胞株,即C5B2、C5B3、C5B4、C5B1、B1A6,效价最高的B1A6株分泌的McAb为IgG3型,纯化后效价为1∶10000,亲和常数为1.08×10-9mol/L,Western印迹鉴定表明cTnⅠMcAb有良好的特异性;兔多抗纯化后的效价为1∶8000。结论:制备了具有良好特性的cTnⅠMcAb和多克隆抗体。     

人β-actin蛋白原核表达及其单克隆抗体制备

为获得分泌抗人β-actin蛋白单克隆抗体（McAb）的杂交瘤细胞,通过在大肠杆菌中原核表达人β-actin蛋白,以纯化的人β-actin蛋白作为抗原免疫BALB/c小鼠。经过细胞的融合及筛选获得1株能稳定分泌抗人β-actin蛋白McAb的杂交瘤细胞,命名为2B4。采用间接ELISA和Western blot方法对McAb的特异性、稳定性和适用范围进行鉴定。结果显示：蛋白的相对分子质量为43 kDa,可溶于8 mol/L尿素;杂交瘤细胞上清的抗体效价为1×10^5,腹水的抗体效价为1×10^7;间接ELISA结果表明,杂交瘤细胞在体外传20代或液氮冻存3个月后,分泌的抗体效价不变;37℃保存24 h后,抗体的效价开始下降。Western blot结果显示,单克隆抗体识别人、鼠、兔和鱼的β-actin蛋白,与其发生特异性反应。2B4分泌的单克隆抗体可以广泛的应用于细胞生物学和免疫学试验,具有良好的应用价值。     

分泌抗芜菁花叶病毒株系特异性单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立及抗体理化性质测定

用经芜菁花叶病毒(TuMV)免疫的BALB／c小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞(Sp2／0－Agl4)融合,经3次克隆化培养和ELISA筛选,建立了5类分泌抗TuMV的单克隆抗体(McAb)的杂交瘤细胞株。其中4类分别对TuMV－CI株系、TuMV—C3株系、TuMV—C4株系和TuMV－c5株系具有特异性反应,第5类对TuMV 5个株系均有反应。以双抗体夹心ELISA和间接ELISA检测,上述McAb同CaMV、CMV、TMV、PVX和PVY等均不产生交叉反应,小鼠腹水McAb的滴度在1：256000--2048000之间,多为1：1024000,比常规多抗血清高400倍左右。对上述杂交瘤细胞系和McAb的生物学特性及理化性质进行了鉴定。用SDS—PAGE、Western—blotting对TuMV外壳蛋白亚基、McAb识别位点进行了分析,并就McAb区分TuMV株系进行了讨。     

单克隆抗体及其在肿瘤中的应用

(一) 概况单克隆抗体(Monoclonal Antibody)简称单抗(McAb),是指单个B淋巴细胞的纯系所产生的抗体。1975年Kohler和Milstein首先创立了B细胞杂交瘤技术。用B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合产生的杂交瘤细胞(Hybridoma),经反复单个细胞培养(cloning和recloning),形成既具有分泌特异性抗体又具有体外长期繁殖能力的细胞系。杂交瘤细胞经多次筛选     

抗汉坦病毒等三种单克隆抗体细胞株的建立及分析应用

以纯化的病毒抗原加完全福氏佐剂,免疫BALB/c小鼠,再利用杂交瘤技术建立针对汉坦病毒、狂犬病毒及乙型脑炎病毒的单克隆抗体(McAb)细胞株,制备并提纯标记McAb,应用于各种实验和检测工作。结果获得了6株分泌抗汉坦病毒McAb杂交瘤细胞株、6株分泌抗狂犬病毒McAb杂交瘤细胞株、2株分泌抗乙型脑炎病毒McAb杂交瘤细胞株,共14株,并对它们的特性进行了分析。各McAb效价不尽相同,有的高达10-7,有的则不足10-3。各McAb亚型以IgG型为主,少数为IgM型;轻链以κ型为主,个别为λ型或阴性。McAb与纯化的病毒抗原有明显的特异性吸附(P<0.01)。有的McAb有相同的作用位点,有的McAb则没有,但与其它McAb有交叉反应。通过对McAb进行提纯和标记,建立了双抗体夹心ELISA法,用于病毒抗原的检测。实验表明获得的McAb有较好的生物学特性,可与相应的病毒抗原特异性结合,用于免疫学检测及其它多种用途。     

抗甲型肝炎病毒单克隆抗体的研究

我们于1984年开展研究抗甲型肝炎病毒(HBV)的单克隆抗体(McAb),得到了3株能连续传代,稳定分泌抗-HAAg的杂交瘤细胞系,抗体在组织培养上清液中的ELISA滴度为1:800～1:1600,腹水为1:10,000—1:100,000。 用ELISA方法检测三株杂交瘤细胞分泌的抗体与经免疫粘附血凝(IAHA),免疫电镜(IEM)证实的5份甲肝抗原和Abbott公司的甲肝抗原均产生特异性反应。但不与正常人     

Nordy, a synthetic lipoxygenase inhibitor, inhibits the expression of formylpeptide receptor and induces differentiation of malignant glioma cells

We recently found that formylpeptide receptor (FPR), a G-protein-coupled receptor that mediates chemotaxis of phagocytic leukocytes induced by bacterial peptide N-formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine, is expressed by malignant human glioma cells and promotes tumor growth and angiogenesis. In this study, we examined the effect of Nordy, a novel chiral lipoxygenase inhibitor which was synthesized based on the structure of a natural nordihydroguaiaretic acid, on the expression of FPR by human glioblastoma cells. We found that FPR was expressed at the protein level by highly malignant human glioma cell lines U87 and BT325, and a rat glioma cell line C6. The expression level of FPR was correlated with the degree of the malignancy of tumor cells. The poorly differentiated glioma cell line U87 expressed the highest level of FPR. In U87 glioma cells, the expression of FPR was attenuated at the protein level by Nordy treatment for 48 (P<0.05). Nordy did not affect FPR mRNA expression in U87 cells. In addition, Nordy treatment seemed to promote glioma cell differentiation, as evidenced by their reduced expression of vimentin and increased expression of GFAP. Our results suggest that Nordy was capable of reducing the level of malignancy of glioma cells.     

Anti-(glioma surface antigen) monoclonal antibody G-22 recognizes overexpressed CD44 in glioma cells

We raised an anti-glioma monoclonal antibody, named G-22, that specifically recognizes a human gliomaassociated surface antigen. Proven to be useful for target imaging of malignant gliomas after radioisotope labeling and cerebrospinal fluid diagnosis by enzyme-linked immunospecific assay, G-22 was found to immunoprecipitate an 83-kDa glycoprotein of the human glioma U-251MG cell. We purified this antigen by G-22-coupled cyanogenbromide-activated Sepharose affinity chromatography, and sequence analysis demonstrated that the 54 amino acid residues were identical to positions 55–108 of human CD44. The results show that the smallest spliced form (85 kDa) of CD44 is strongly expressed in glioma cells.     

抗肿瘤单抗3H11对应抗原cDNA片段的克隆

单克隆抗体３Ｈ１１能与多种肿瘤细胞特异结合,克隆其对应抗原无疑具重要意义．用胃癌细胞ＭＧＣ８０３构建ｃＤＮＡ表达文库,通过抗体３Ｈ１１对其进行原核表达筛选,获得一株能与３Ｈ１１特异反应的阳性克隆．其ｃＤＮＡ插入片段为５５４ｂｐ．ＧｅｎＢａｎｋ不含其同源序列．将此ｃＤＮＡ片段与谷胱甘肽转移酶表达质粒ｐＧＥＸ－４Ｔ重组,Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ和竞争抑制实验表明,表达产物依然保持同３Ｈ１１反应的特异性．可见它是３Ｈ１１对应抗原的ｃＤＮＡ．     

转化相关蛋白p86的鉴定

以转化细胞Rat3-3免疫大鼠,获得单克隆抗体E5(MeAb E5)。其对应抗原耐热,是分子量为86kD的蛋白质(P86)。它在c-Ha-ras癌基因转化的细胞上均有较高的阳性表达,而在其相应的非转化细胞上含量甚微。以人工合成的反义c-Ha-ras寡聚核苷酸As-Ⅱ处理Rat3-3细胞,该细胞生长受抑(44.2％),,此对p86的表达亦降低(39.1％)。P86在五种人胃癌细胞系中均有较高表达,在原发胃癌及其转移灶中阳性率达82.6％。p86不仅是一种与C-Ha-ras转化相关的蛋白,而且为胃癌相关抗原。     

Overexpression of high molecular weight FGF-2 forms inhibits glioma growth by acting on cell-cycle progression and protein translation

In order to clarify the role of HMW FGF-2 in glioma development and angiogenesis, we over-expressed different human FGF-2 isoforms in C6 rat glioma cell line using a tetracycline-regulated expression system. Phenotypic modifications were analyzed in vitro and compared to untransfected cells or to cells over-expressing 18 kDa FGF-2 or all FGF-2 isoforms. In particular, we demonstrate that HMW FGF-2 has unique features in inhibiting glioma cell proliferation. HMW FGF-2 expressing cells showed a cell-cycle arrest at the G2M, demonstrating a role of HMW FGF-2 in controlling the entry in mitosis. Moreover, hydroxyurea was ineffective in blocking cells at the G1S boundary when HMW FGF-2 was expressed. We also show that the HMW FGF-2 isoforms inhibit 4E-BP1 phosphorylation at critical sites restoring the translation inhibitory activity of 4E-BP1. In vivo, inhibition of tumor growth was observed when cells expressed HMW FGF-2. This indicates that HMW FGF-2 inhibits tumor growth in glioma cells by acting on cell-cycle progression and protein translation.     

抗人血栓调节蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

为了制备特异性抗人血栓调节蛋白(human thrombomodulin,hTM)的单克隆抗体(monoclonal antibody,McAb),利用脂质体Lipofectamine 2000将包含hTM全长cDNA序列的重组表达质粒pThr402转染CHO细胞,经G418筛选及相关鉴定后获得高效稳定表达hTM的CHO-TM5细胞株。将CHO-TM5细胞直接免疫Balb/c小鼠,应用杂交瘤技术,通过细胞ELISA (cellular enzyme-linked immunoabsorbent assay,CELISA)筛选出阳性克隆后,将杂交瘤细胞株腹腔注射Balb/c小鼠诱生腹水。用CELISA、流式细胞术、免疫组织化学染色法及免疫印迹法对所获McAb的特异性进行鉴定。我们获得了1株可稳定分泌抗hTM的McAb的杂交瘤细胞株NH-1,其亚型为IgGl,McAb腹水效价为1×10~(-6),腹水抗体含量为20 mg/ml。NH-1对相应抗原具有较高的组织特异性,在体内与正常组织的交叉反应少,对人脐静脉内皮细胞、CHO-TM5有特异性结合反应,说明NH-1可特异性识别天然的hTM分子,为进一步应用此McAb进行hTM生物学功能及临床意义研究提供了基础。     

miR-217慢病毒表达载体及稳转胶质瘤细胞系的构建

目的:构建mi R-217慢病毒表达载体并建立稳定表达mi R-217的胶质瘤细胞系,为深入研究mi R-217在胶质瘤细胞生长及功能中的作用及机制提供条件。方法:利用人基因组中mi R-217前体序列,设计并合成引物。采用PCR的方法扩增含mi R-217前体的目的片段,酶切后连接至慢病毒表达载体p LVX-EGFP-Puro。将带有mi R-217前体的慢病毒载体及辅助质粒用脂质体的方法转染293细胞,24小时后收集上清液测定病毒滴度。利用实时定量PCR检测mi R-217的表达水平,确定慢病毒载体的表达能力。将病毒感染胶质瘤细胞系U251,通过荧光观察和嘌呤霉素(Puromycin)筛选,获得稳定转染mi R-217的胶质瘤细胞系。结果:克隆的mi R-217前体目的片段经PCR检测和测序分析,序列完全正确、无突变。实时定量PCR检测发现慢病毒感染293T细胞后,mi R-217的表达水平明显升高(P0.01),表明mi R-217慢病毒表达载体构建成功。经嘌呤霉素筛选后,荧光显微镜观察发现细胞均有稳定的绿色荧光表达,并且mi R-217的表达水平显著升高(P0.01),是对照组的12.5倍。结论:成功构建了mi R-127慢病毒表达载体和稳转胶质瘤细胞系,为后续研究奠定了良好基础。     

转录因子SOX9基因对脑胶质瘤干细胞干性维持的相关性研究

目的:应用慢病毒干扰SOX9的表达,观察其对脑胶质瘤干细胞干性维持的影响。方法:设计2条针对SOX9转录短发夹RNA(sh RNA)的DNA序列,构建慢病毒并感染胶质瘤细胞系U87、U251细胞,利用嘌呤霉素筛选稳转细胞。在转录水平及蛋白水平检测SOX9的沉默效果,利用荧光实时定量PCR(q RT-PCR)及免疫荧光染色检测相应干细胞相关标志分子SOX2、Nestin的表达差异。比较诱导形成的胶质瘤干细胞成球能力(肿瘤干细胞成球的直径),同时利用荧光实时定量PCR(q RT-PCR)及免疫荧光染色对干细胞相关标志物SOX2、Nestin的表达水平进行比较。结果:SOX9成功包装慢病毒并有效感染U87、U251细胞,实时荧光定量PCR检测其抑制率分别可降低83.74%和80.12%。并且在稳转细胞系水平相关干细胞标志分子表达含量有明显下降。在干细胞层面沉默SOX9可以明显抑制胶质瘤细胞诱导成球的直径(P0.01),同时免疫荧光显示肿瘤干细胞相关干性分子SOX2、Nestin的表达水平较对照组明显降低。结论:慢病毒感染沉默SOX9基因可以抑制胶质瘤干细胞干性的维持,为胶质瘤的生物治疗提供了重要的靶点。     

ADAR1 shRNA对人胶质瘤U87细胞增殖和凋亡的影响

目的:研究ADAR1 shRNA对人胶质瘤细胞U87细胞增殖和凋亡的影响。方法:通过构建ADAR1-shRNA的干扰质粒,经脂质体法转染胶质瘤U87细胞系,通过荧光倒置显微镜观察转染效率,选择转染效率最高的细胞系。取转染48h细胞,采用RT-PCR和Western-blot分别检测ADAR1 mRNA及蛋白的表达,流式细胞仪检测其细胞凋亡率,MTT法检测细胞增殖情况。结果:①经ADAR1-shRNA转染48h后的转染效率最高,此时U87细胞系中ADAR1 mRNA及蛋白的表达均被显著抑制,较阴性对照组及空白组均明显降低(P0.05)。②在转染ADAR1-shRNA后,细胞凋亡率为(28.14%±3.76%),明显高于阴性对照组(3.20%±1.57%)和空白组(2.80%±1.49%),细胞增殖率较阴性对照组及空白组明显下降(P0.05)。结论:通过shRNA抑制ADAR1的表达能明显促进人胶质瘤细胞U87细胞的凋亡和抑制其增殖,ADAR1基因可能成为治疗治疗胶质瘤的新靶点。