分泌抗马铃薯Y病毒单克隆抗体的大鼠杂交瘤细胞系的建立及抗体稳定性测定

用大鼠的骨髓瘤细胞系(1R983)与经马铃薯Y病毒(PVY)免疫的大鼠(LOU／c)脾细胞融合,建立了3类分泌抗该病毒株系特异性单克降抗体(McAB)的杂交瘤细胞系。其一对 PVYn具有特异性反应,其二对PVYo。具有特异性反应;其三对PVY n和PVYn。均产生反应。经用ELIAA双抗体夹心法和ELlsA间接法检测,上述(McAb)同TMv、CMV、TEV,AMV、 TuMV、PLRV,PVX七种植物病毒均不产生交叉反应。对上述杂交瘸纲胞系和McAb的生 物学特性及理化特性进行了鉴定。     

马IgM、IgG单克隆抗体的研制与鉴定

以马IgM、luG作为免疫抗原,以此免疫BALB/c小鼠,并取其脾细胞与骨髓瘤细胞(SP2.0)融合,通过酶联免疫吸附试验(ELISA)方法筛选,结果获得了4株分泌抗马IgM和2株分泌抗IgG的单克隆抗体的杂交瘤细胞,特异性试验证明,4株IgM单抗有很好的特异性,仅与马的IgM特异反应,而不与IgG反应;这4株单抗分别命名为IgM4H、IgM6B、IgM8A和IgM12F.经鉴定,IgM4H、IgM6B、IgM12F株为IgG1亚类,IgM8A株为IgG2a亚类,杂交瘤细胞的平均染色体数目为99条.杂交瘤细胞培养上清液及小鼠腹水McAb的ELISA都具有较高的效价,该杂交瘤细胞连续培养20代后仍能稳定分泌抗体.2株IgG的单克隆抗体有很好的特异性,只与IgG反应,而不与IgM发生交叉反应.     

芜菁花叶病毒单克隆抗体的制备及检测应用

先以芜菁花叶病毒（TuMV）免疫BAL B/C小鼠,然后取其脾细胞使之与SP2/0鼠骨髓瘤细胞融合,经筛选、克隆,获得4株能稳定传代并分泌抗TuMV单克隆抗体（Mab）的杂交瘤细胞,并以之制备腹水单抗。4株单克隆抗体腹水ELISA效价在10-5～10-6之间,仅对TuMV起特异性反应。Western blot分析表明,4株单抗都能与TuMV 34kD的外壳蛋白亚基起特异反应。利用TuMV的多抗兔血清和单抗腹水建立了三抗体夹心ELISA检测TuMV的方法,检测病叶的灵敏度为1∶5120倍,检测提纯TuMV病毒绝对量为21.9 ng。利用三抗体夹心ELISA测定出7种作物上有TuMV侵染。      

草鱼生长激素单克隆抗体杂交瘤细胞系的建立及鉴定

用经草鱼生长激素(gcGH)免疫的BALB/c小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞(Sp2/O-Ag14)融合,经3次克隆化培养和ELISA筛选,得到7株阳性杂交瘤细胞株,其中2株为强阳性。交叉试验表明,这些杂交瘤细胞株所分泌的单克隆抗体(McAb)同大鳞大马哈鱼生长激素(sGH)、大鳞大马哈鱼促性腺激素(sGTH)及牛生长激素(bGH)均不起反应。小鼠腹水McAbs滴度高达1:1280000。受体-gcGH-McAb夹心试验表明,McAb确与有活性的gcGH有特异反应。用间接ELISA方法可检测到浓度为0.125#g/ml的gcGH。     

抗B型葡萄球菌肠毒素单克隆抗体的研制及其鉴定

本文用纯化B型葡萄球菌肠毒素(SEB)免疫Balb/c小鼠的脾细胞与SP2/O骨髓瘤细胞融合,经筛选及克隆化共获6株能稳定分泌抗SEB的单克隆抗体(McAb)杂交瘤细胞株。通过将以混合佐剂(降植烷 FIA的混合物)和杂交瘤细胞同时注射制备McAb腹水的方法与常规法相比较,不仅量多(多1.56～1.84倍),而且活性好(高1个数量级)。初步鉴定表明:6株McAb均属IgGl亚类;其培养上清和腹水的ELISA滴度分别为10~(-3)～10~(-4)和10~(-5)～10~(-8)。它们与SEA均不起反应,其中3株(Sl.B4和E7)与SECl有轻微交叉反应;都能被10μg/m的SEB完全阻断等。说明其免疫学活性及特异性均较良好。     

分泌抗马铃薯X病毒株系特异性单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立及抗体理化性质测定

用马铃薯x病毒(Pvx)免疫的BALB／c小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞(SP2／0)融合,经3次克隆化后,筛选出3类分泌抗PVx株系特异性的单克隆抗体(McAb)杂交瘤细胞株,该细胞株经传代20代以上,并经液氮冻存一年以后仍表现稳定。3个杂交瘤细胞株染色体数目集中在92—102条之间,其免疫球蛋白亚类均为IgG3,用ELlsA间接法测定细胞培养上清滴度为1：320—1：640,小鼠腹水抗体滴度为1：102400—1：204800,后者比兔抗血清滴度(1：320)高300倍以上。McAb对抗原具有中和作用,中和滴度为1：102。经反复冻融、硫铵沉淀和冻干后,抗体活性无明显变化。     

抗HSV-1淋巴细胞杂交瘤的建立及应用单克隆抗体对HSV分型

应用HSV-1 SM44株感染的BHK-21细胞及提取的感染细胞膜蛋白抗原免疫Balb/c小鼠。以免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞系Sp_2/0融合,经ELISA筛选仅与HSV-1反应的阳性克隆及克隆化,建立了一株产生抗HSV-1型特异性McAb的杂交瘤细胞系(Mad-2)。经ELISA,IF及抗原吸收试验证明,该细胞系的培养上清及制备的小鼠腹水均与HSV-1呈特异性反应,但不与HSV-2反应。ELISA测定McAb Mad-2的腹水效价为10~(-7)Ig亚类鉴定为IgG-1。应用Mad-2和抗HSV型共同性McAb 1A12及抗HSV-2型特异性McAb CH-A9,对43株临床HSV分离株做了ELISA及IF分型。结果表明,28株口唇、眼部感染分离株和1株宫颈炎分离株均与1A12和Mad-2反应,不与CH-A9反应,为HSV-1。余14株富颈炎分离株均与1A12和CH-A9反应,而不与Mad-2反应,为HSV-2。ELISA和IF分型的结果完全一致。本研究提出作者应用的一套抗HSVMcAb有可能作为HSV型别鉴定的标准试剂。     

人心肌肌钙蛋白Ⅰ单克隆抗体及多克隆抗体的制备

目的:以重组人心肌肌钙蛋白Ⅰ(cTnⅠ)为抗原制备鼠源单克隆抗体(McAb)及兔源多克隆抗体,并鉴定抗体的特性。方法:以纯化的重组人cTnⅠ为抗原免疫BALB/c小鼠,取鼠脾细胞同Sp2/0骨髓瘤细胞融合,利用选择培养基筛选融合的杂交瘤细胞,用有限稀释法分离获得能够稳定分泌抗cTnⅠ的McAb阳性克隆,并利用体内诱生法大规模制备McAb,用辛酸-硫酸铵沉淀法纯化抗体;兔多抗制备以cTnⅠ为抗原常规免疫后取其血清;用间接ELISA和Western印迹鉴定抗体的性质。结果:经ELISA鉴定,筛选出5株能分泌cTnⅠMcAb的杂交瘤细胞株,即C5B2、C5B3、C5B4、C5B1、B1A6,效价最高的B1A6株分泌的McAb为IgG3型,纯化后效价为1∶10000,亲和常数为1.08×10-9mol/L,Western印迹鉴定表明cTnⅠMcAb有良好的特异性;兔多抗纯化后的效价为1∶8000。结论:制备了具有良好特性的cTnⅠMcAb和多克隆抗体。     

安徽省流行性出血热病毒杂交瘤单克隆抗体的研制与应用

用流行性出血热病毒(EHFV)李株和陈株血凝素(HAN)分别免疫Balb/C小鼠,取其脾细胞和骨髓瘤细胞SP2/O融合,杂交瘤生长孔率为97.5％和60％,阳性率各为2.5％和22％,克隆化培养阳性率达到100％。通过筛选得2株杂交瘤细胞、一株为2B_7、另一株为1H_8。其腹水单克隆抗体(McAb)滴度均达1∶16×10~4—32×10~4。1H_8的血凝抑制滴度达1∶5120。经染色体核型分析,杂交细胞染色体2B_7为80—97条,1H_8为85—105条,每个细胞均含一条中着丝点标记染色体。McAb的Ig类别和IgG亚类检测结果2B_7为IgM,1H_8为IgG_(2b)。两者对19株不同来源的EHFV具有不同的反应,1H_8McAb与19株都具有不同程度的免疫荧光反应,滴度都较高,且对5株不同来源的EHFV-HAN具有血凝抑制活性,滴度在1∶1280—5120,故1H_8为血凝抑制抗体;2B_7只对12株EHFV起反应,对7株不起反应,且没有血凝抑制活性。这说明1H_8与2B_7具有不同的特性。     

BALB/C鼠冷诱导RNA结合蛋白的原核表达、纯化及其单克隆抗体的制备

为了获得冷诱导RNA结合蛋白（CIRP）的单克隆抗体,本通过RT-PCR 方法从冷处理BALB/C小鼠睾丸的总RNA中扩增获得CIRP基因序列,克隆至pGEM-T载体,获得重组质粒pGEM-CIRP,并进行序列测定。将测序正确的CIRP序列插入质粒pQE-30-Xa,构建表达载体pQE-30-CIRP并转化E.coli M15,IPTG 诱导后SDS-PAGE分析表明CIRP基因在大肠杆菌中获得高效表达, 可溶性分析表明CIRP融合蛋白以包涵体形式表达。采用Ni-NTA亲和层析、电洗脱纯化融合蛋白CIRP,将纯化的蛋白免疫BALB/C小鼠,三次免疫后,间接ELISA测定小鼠效价,效价为1:105,采用杂交瘤技术融合,用间接ELISA法、有限稀释法筛选阳性杂交瘤细胞,通过Western blot对McAb特异性进行鉴定,利用间接ELISA方法对McAb的Ig亚类(型)、杂交瘤细胞上清、腹水效价进行测定。结果获得了1A6、2D3、3C5及4C4 4株稳定分泌CIRP McAb的杂交瘤细胞株,1A6、3C5、4C4产生的单克隆抗体亚类均为IgG2b,2D3产生的单抗亚类为IgG3,轻链均属κ链。4株单克隆细胞上清效价均在1:103以上,腹水效价均达1:107以上。Western-blot分析4株单抗均能与重组蛋白CIRP特异性结合,与空载体对照没有反应。以3C5细胞株的腹水为一抗,检测冷应激小鼠多种组织中天然CIRP蛋白表达,结果显示3C5细胞腹水能识别心、肝、脾、肺、肾、脑、睾丸等多种组织中天然CIRP,并与能之与结合。这证明该抗体具有良好特异性和结合活性,制备的单克隆抗体可以用于深入开展CIRP的功能性和应用性研究。     

马铃薯卷叶病毒单克隆抗体的制备

马铃薯卷叶病毒(Potato leafroll virus,PLRV)在植物体内数量很少,难以提纯足够量病毒进行免疫,至今未见国内有制备PLRV单克隆抗体(McAb)的报道.本文以本室以前报道的方法提纯马铃薯卷叶病毒作为抗原,直接注入Balb/c小鼠脾脏,随后从尾静脉加强注射,采用杂交瘤技术建立了4个分泌抗PILRV McAb的杂交瘤细胞株。经微量免疫双扩散法鉴定,杂交瘤细胞株A1、A3、D3分泌的McAb均属gG1亚类,C3株者属IgG2a,它们的轻链都是λ型。将0.5ml含10~8个A1,A3,C3,D3杂交瘤细胞注入     

抗人血栓调节蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

为了制备特异性抗人血栓调节蛋白(human thrombomodulin,hTM)的单克隆抗体(monoclonal antibody,McAb),利用脂质体Lipofectamine 2000将包含hTM全长cDNA序列的重组表达质粒pThr402转染CHO细胞,经G418筛选及相关鉴定后获得高效稳定表达hTM的CHO-TM5细胞株。将CHO-TM5细胞直接免疫Balb/c小鼠,应用杂交瘤技术,通过细胞ELISA (cellular enzyme-linked immunoabsorbent assay,CELISA)筛选出阳性克隆后,将杂交瘤细胞株腹腔注射Balb/c小鼠诱生腹水。用CELISA、流式细胞术、免疫组织化学染色法及免疫印迹法对所获McAb的特异性进行鉴定。我们获得了1株可稳定分泌抗hTM的McAb的杂交瘤细胞株NH-1,其亚型为IgGl,McAb腹水效价为1×10~(-6),腹水抗体含量为20 mg/ml。NH-1对相应抗原具有较高的组织特异性,在体内与正常组织的交叉反应少,对人脐静脉内皮细胞、CHO-TM5有特异性结合反应,说明NH-1可特异性识别天然的hTM分子,为进一步应用此McAb进行hTM生物学功能及临床意义研究提供了基础。     

巨细胞病毒单克隆抗体的建立和应用

应用人巨细胞病毒(CMV)AD169株免疫BALB/C小鼠,取脾细胞与SP 2/0小鼠骨髓瘤细胞融合,得到4株(12H、3H、47C和6H)能分泌单克隆抗体(McAb)的杂交瘤细胞。其中47C株McAb(滴度≥512 000)经辣根过氧化物酶标记,能与细胞培养中的AD169株和Davis株CMV发生特异性核内染色反应。14份出现CMV典型病变的临床阳性标本中,12份呈明显的阳性反应,另2份为弱阳性反应,而对正常细胞及感染其它病毒的细胞均无染色反应,说明该McAb具有较好的特异性。用于鉴定分离的毒株,一天内可出结果,比中和试验快速、简便。     

癌胚抗原单克隆抗体的制备及免疫学性状的研究

用由结肠癌肝转移灶纯化的cEA抗原免疫BALB／c小鼠,其脾细胞与鼠骨髓瘤细胞sP2／0融合,制备产生cEAMcAb的杂交瘤。用ELIsA法检测与c已A,NcA、NcA一2的反应特异性。获得8株仅与cEA有结合反应的McAb,通过阻断抑制试验证明这8株McAb认识cEA分子上三个不同的抗原决定簇。它们的免疫球蛋白亚类同是IgG-．     

电融合产生黄瓜花叶病毒的单克隆抗体

用提纯的黄瓜花叶病毒(CMV)种传SS-30株和豇豆株(P株)混合免疫BALB／c小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2／0,用BAEKON 2000基因转移仪使其融合。通过2—3次简易、快速的有限稀释,获得6个能持续分泌抗体的杂交瘤细胞株,所获抗体分属IgG．和IgG∽井能诱导高滴度腹水抗体。间接ELISA试验证明这些单克隆抗体对种传CMvss一30株、P株和非种传CMV的黄化、日本、山东、香蕉。向日葵和Q等分离物有特异性反应,与c,·分离物的反应性较弱,而对花生矮化病毒(PSV)无交叉反应。利用间接ELISA测定了几个单克隆抗体的亲和力常数。单克降抗体C7H3、A6H4与G4G4、G4H5所抗的抗原决定簇相距较远,而C2H3 与A6H4 G+G8与G4H4为抗同一抗原决定簇的草克隆抗体。     

抗组织型纤溶酶原激活剂(tPA)单克隆抗体的制备和鉴定

用从人黑色素瘤细胞培液中提纯的tPA为抗原,通过杂交瘤技术获得TA₁,TA₂、TA₃和TA₄ 4株阳性杂交瘤细胞。经葡萄球菌A蛋白(SPA)亲和层析纯化抗tPA单克隆抗体(tPA．McAb)。固相酶联免疫吸附测定(ELISA)诱生含McAb的小鼠腹水,其效价达I：1O⁵。这些tPA McAb均属IgG₁亚型,特异地作用于tPA(包括基因工程生产的rtPA),与尿激酶(uK)无反应。用底物显色法测定表明所有tPA McAb均可抑制tPA的活性。     

抗甲3型(H3N2)流行性感冒病毒单克隆抗体的建立

将SP2/0 Ag小鼠骨髓瘤细胞与经蔗糖梯度离心纯化的甲3型流感病毒沪防/32/84(H3N2)免疫的BALB/C鼠脾细胞融合,经初步克隆获得了25个能稳定分泌抗甲3型流感病毒单克隆抗体(McAb)的杂交瘤细胞株,部份McAb的一些生物学性状如下。 经ELISA测定25个腹水McAb、除4株为10~(-4)外,其余滴度在10~(-5)～10~(-(?))间。此25个McAb中,16个为抗血凝素McAb,其中15个的血凝抑制效价在1:1,280～1:20,480,1个为1:320,在鸡胚内均有不同     

牛轮状病毒单克隆抗体的制备及其应用

以纯化浓缩的HN-7株牛轮状病毒(牛RV,从河南腹泻犊黄牛粪样中分离)作为免疫原,免疫Balb/c小鼠,取其脾细胞与同系小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合,经克隆化筛选出2株(2C_7和3C_9)具群特异性的单克隆杂交瘤细胞株。2C_7与3C_9的小鼠腹水单克隆抗体(McAb)与牛HN-7、BRV007、BRV014及NCDV,猪Na86,猴SA-11和人Wa株RV细胞培养物的间接ELISA反应效价均达1∶10~5,但它们的HI和NT滴度分别≤1∶8和≤1∶100。McAb的Ig类别和IgC亚类检测结果2C_7为IgG1,3C_9为IgG2b。分别用3C_9 McAb和多克隆抗血清(PcAb)包被微量反应板进行粪样中RV抗原检测,共检测犊黄牛腹泻粪样36份、婴幼儿腹泻粪样40份,McAb和PcAb两系统检测结果的符合率分别达到97.2％(35/36)和100％(40/40)。     

人β-actin蛋白原核表达及其单克隆抗体制备

为获得分泌抗人β-actin蛋白单克隆抗体（McAb）的杂交瘤细胞,通过在大肠杆菌中原核表达人β-actin蛋白,以纯化的人β-actin蛋白作为抗原免疫BALB/c小鼠。经过细胞的融合及筛选获得1株能稳定分泌抗人β-actin蛋白McAb的杂交瘤细胞,命名为2B4。采用间接ELISA和Western blot方法对McAb的特异性、稳定性和适用范围进行鉴定。结果显示：蛋白的相对分子质量为43 kDa,可溶于8 mol/L尿素;杂交瘤细胞上清的抗体效价为1×10^5,腹水的抗体效价为1×10^7;间接ELISA结果表明,杂交瘤细胞在体外传20代或液氮冻存3个月后,分泌的抗体效价不变;37℃保存24 h后,抗体的效价开始下降。Western blot结果显示,单克隆抗体识别人、鼠、兔和鱼的β-actin蛋白,与其发生特异性反应。2B4分泌的单克隆抗体可以广泛的应用于细胞生物学和免疫学试验,具有良好的应用价值。     

长叶车前花叶病毒单克隆抗体的制备及在病毒分型中的应用

应用细胞杂交技术,将长叶车前花叶病毒杭州分离株(RMVha)、烟草花叶病毒普通株(TMVc)和北京番茄株(TMVbe-t)免疫的Balb/c小鼠脾细胞与Sp2/0-Ag14小鼠骨髓瘤细胞融合,经筛选测定,成功地获得了5株稳定分泌特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株,其中1株属于IgG_(2b),其余4株均属于IgG_(?),5株细胞株均制备了腹水抗体,ELISA效价最高达256000,琼脂双扩散效价达128,根据与15个不同RMV和TMV毒株的反应特性,可将5株单克隆抗体分为A、B、C三组,分别针对a、b、c三个不同的抗原决定簇。根据三组单克隆抗体反应性的差异,15个毒株可分为8个血清型,本文讨论了所获得的5株杂交瘤细胞在植物病毒的诊断、病毒病原的鉴定及病毒分型方面的应用价值。