重组蛋白AgrC的表达纯化及人工超分子体系的构建

目的:克隆表达金黄色葡萄球菌agr系统的受体蛋白AgrC,构建人工超分子体系。方法:构建基因工程菌E.coli TOP10-pBAD-AgrC,对诱导条件进行优化,对蛋白的提取方法进行分析优化。表达产物使用Western blot鉴定,His-tag镍柱亲和层析纯化。使用肽脂质N+C5Gly2C16为膜材料制备囊泡作为载体,将纯化后的蛋白在囊泡上镶嵌。结果:构建的基因工程菌在18℃,0.002%的阿拉伯糖浓度下具有最高的表达效率,以内膜形式存在的AgrC蛋白在表面活性剂BDH中溶解效率最佳。结论:成功诱导表达并纯化了重组蛋白AgrC,成功利用其构建了人工超分子体系。     

SCG10基因重组质粒的构建及蛋白表达和定位

目的构建SCG10真核表达载体并证实融合蛋白在细胞内表达及定位。方法以人胎脑cDNA文库为模板,PCR扩增SCG10全长编码基因,亚克隆至pEGFP-C1表达载体中。将构建的重组质粒测序并转染到人胚肾HEK293中,提取细胞蛋白进行Western blot检测。利用共聚焦激光扫描显微镜观察pEGFP-SCG10在HEK293细胞内定位。结果 SCG10全长基因序列克隆到了真核表达载体pEGFP-C1中,酶切鉴定片段大小540bp。Western blot检测到了融合蛋白表达,分子量约为48kD。pEGFP-SCG10在细胞内定位以细胞浆为主,在细胞核少量表达。结论成功构建了SCG10全长基因真核表达载体,pEGFP-SCG10蛋白主要定位于HEK293细胞浆内。     

外源基因表达与代谢超负荷

随着重组DNA技术的出现,各种基因大量地被分离定型,然后在外源宿主细胞内表达。生物技术研究成果的产业化正迅猛发展,如克隆多拷贝的基因或采用高质粒拷贝数的克隆载体;采用在基因序列上游含有翻译信号的载体;选用带有强转录启动子的克隆载体等等。但是,宿主细胞的表达水平是有限的,因为外源基因在宿主细胞内的表达水平是有限的,因为外源基因在宿生细胞内的表达要利用宿主细胞的大量资源,并增加其代谢负荷。这种强加的代谢超负荷,会导致宿主细胞的生物化学和生理学改变,如果这些改变较大,可降低目的蛋白的产生和回收量。该综…     

成熟天花粉蛋白基因在酵母中的表达

本文利用DNA重组技术,将酵母α因子的启动子和信号序列与成熟天花粉蛋白基因融合,从而构建了天花粉蛋白的酵母表达载体。将该载体转入酵母细胞,转化子在选择培养基中培养24小时后,获得了高效表达。表达的天花粉蛋白位于细胞内。     

免疫刺激诱导草鱼肿瘤坏死因子TNF-的体外表达特征研究

为了阐明免疫刺激诱导草鱼肿瘤坏死因子TNF-的体外表达特征, 克隆了草鱼TNF-的cDNA, 构建了原核表达载体pET-32-TNF-, 并在大肠杆菌DH5中表达了His6-TNF-。利用亲和层析镍柱纯化表达重组蛋白后将其作为免疫原免疫小鼠制备了抗草鱼TNF-多克隆抗体。免疫印迹实验显示, 制备的抗体能特异性识别细胞内源性TNF-。在此基础上, 分别研究了GCRV(草鱼呼肠孤病毒)感染、免疫刺激物Poly(I:C)及LPS处理下不同时间点草鱼肾细胞CIK中TNF-的表达情况, 结果表明, TNF-在草鱼肾细胞内翻译水平的表达量基本保持稳定。研究显示经典的TNF信号通路激活因子不能引起CIK细胞内TNF-蛋白水平的显著变化。     

包装信号可以被Cre重组酶切除的辅助性腺病毒的构建及鉴定

目的:为了探索构建第三代复制依赖性腺病毒载体系统的有效实验方法,利用细菌内重组原理,分别构建了第三代腺病毒生产体系中的辅助性腺病毒和表达Cre重组酶的真核表达载体,并分析了Cre切除辅助病毒包装信号的有效性。方法:通过PCR及酶处理法依次将2个同向的loxP位点及绿色荧光蛋白表达盒克隆至pShuttle穿梭载体质粒,按照AdEasy系统的标准实验方法产生和扩增辅助病毒;同时构建pcDNA3.1(+)-cre真核表达载体,并用该载体经脂质体法转染HEK293细胞,通过PCR和流式细胞术分析转染细胞内表达的Cre重组酶对随后感染的辅助病毒的包装信号的切除作用。结果:构建的辅助性腺病毒能够在HEK293细胞内扩增,其包装信号可以由细胞内表达的Cre重组酶有效切除。结论:构建了辅助性腺病毒和pcDNA3.1(+)-cre真核表达载体,为第三代腺病毒的生产奠定了实验基础。     

庚型肝炎病毒全长基因在体外的表达

利用第二军医大学微生物学教研室克隆的庚型肝炎病毒 (HGV)全长基因组 (HGVqz) ,构建由不同启动子调控的HGV表达载体 ,将 2种表达载体及HGV全长基因片段进行体外表达 ,探讨此HGV全长基因克隆的功能。利用脂质体将HGV全长基因cDNA以及表达载体转入Changliver或NIH 3T3细胞进行瞬时表达 ,分别提取转染72h后转染细胞的RNA及蛋白质进行RT PCR及Westernblotting ,以检测HGV基因的表达。RT PCR及Westernblotting结果表明 ,HGV全长基因cDNA以及 2种表达载体均可以在体外培养的细胞内表达 ,其表达产物为HGV前体蛋白 ,分子量约为 310ku。第二军医大学微生物学教研室克隆的HGV全长基因具有正确的开读框架和可表达性 ,能表达HGV前体蛋白 ,但在体外培养细胞内不能完成前体蛋白的剪切     

PML-C与GINS2蛋白相互作用的胞内验证

目的 通过胞内实验验证PML-C与GINS2蛋白之间的相互作用.方法 将诱饵蛋白质粒pGBKT7-PML-C和文库蛋白质粒pACT2-GINS2共转化AH109酵母菌,通过一对一的酵母双杂交技术验证两者在活细胞内的相互作用;构建pCMV-HA-PML-C及pCMV-Myc-GINS2真核表达载体并共转染人胚肾293细胞,利用免疫共沉淀技术验证二者之间的相互作用.结果 pGBKT7-PML-C诱饵蛋白质粒和pACT2-GINS2靶蛋白质粒共转化AH109酵母菌后,可见蓝色阳性克隆生长;pCMV-HA-PML-C及pCMV-Myc-GINS2真核表达载体构建成功,共转染293细胞,抗HA多克隆抗体沉淀与HA-PML-C相互作用的蛋白复合物后,用抗Myc单克隆抗体进行Western印迹检测,可以检测到Myc-GINS2蛋白.结论 利用酵母双杂交和免疫共沉淀技术在胞内验证了PML-C与GINS2间存在相互作用.     

p65蛋白的诱导表达及电子显微镜观察其显微结构

目的:构建重组原核表达载体pGEX-5x-1-p65,诱导GST-p65融合蛋白的表达并观察其包涵体的显微结构.方法:应用PCR技术扩增得到p65全长序列,并亚克隆至带有GST标签的pGEX-5x-1载体中.经酶切、测序鉴定后,在原核细胞中诱导表达GST-p65融合蛋白并将诱导后的菌体制作透射电镜标本,观察菌体内部显微结构.结果:成功构建表达载体pGEX-5x-1-p65,原核细胞中诱导表达、凝胶电泳后未见可溶性融合蛋白的高效表达.透射电镜观察到在承载有重组载体的菌体内部出现大量高电子密度的包涵体.结论:成功构建了原核表达载体pGEX-5x-1-p65,电子显微镜观察并证实在原核细胞内p65蛋白诱导表达形成包涵体.     

线粒体锚定对凋亡诱导因子抗氧化应激功能的影响

目的:构建带线粒体锚定信号肽的凋亡诱导因子(AIF)融合表达载体,研究在A549细胞中AIF线粒体锚定与其抗氧化应激功能的关系。方法:利用PCR将AIF原有线粒体定位信号(1-120 aa)替换成具有锚定功能的细胞色素c氧化酶Ⅳ亚型(COXⅣ)线粒体定位信号,并将COX-AIF克隆至pEGFP-N1和pDsRed1-N1载体,构建COX-AIF-GFP和COX-AIF-RFP融合表达载体;利用免疫印迹和激光共聚焦技术检测COX-AIF-GFP和COX-AIF-RFP的表达及其与线粒体的共定位;利用DCF染色和流式细胞技术检测A549细胞内过氧化物的水平。结果:表达了COX-AIF-GFP和COX-AIF-RFP融合蛋白,COX-AIF-GFP/RFP及AIF-RFP/RFP均定位于线粒体;与野生型AIF-RFP相比,COX-AIF-RFP可显著提高A549细胞的抗氧化应激能力。结论:AIF抗氧化应激能力依赖其在线粒体内膜的锚定。     

δ-睡眠肽与GFP融合蛋白的表达和纯化

构建δ-睡眠肽(DSIP)蛋白与GFP的融合基因表达载体,高效表达和纯化GFP-DSIP融合蛋白。通过SOE-PCR拼接DSIP全长编码基因,并使得DSIP上游具有肠激酶识别位点,经双酶切定向克隆至表达载体pET-28a,构建重组载体pET-28a-DSIP,通过PCR扩增GFP全长编码基因,经双酶切定向克隆至pET-28a-DSIP,构建原核重组表达载体pET-28a-GFP-DSIP,通过双酶切和测序鉴定后,导入E.coli BL21宿主菌中,IPTG诱导表达融合蛋白,采用镍亲和层析和分子筛凝胶层析获得高纯度蛋白,SDS-PAGE分析鉴定。经测序鉴定成功构建了原核重组表达载体pET-28a-GFP-DSIP,在IPTG诱导下获得可溶性的绿色荧光蛋白与睡眠肽的融合蛋白,经Ni-NTA亲和层析纯化成功获得高纯度的融合蛋白。成功构建了DSIP与GFP融合基因的重组表达载体,确定了GFP-DSIP融合蛋白诱导表达的最佳条件,获得了较高纯度的融合蛋白,为进一步研究DSIP蛋白的生物学功能奠定了基础。     

果蝇心脏发育标记基因Hand多克隆抗体的制备

制备果蝇心脏标记基因Hand抗体对研究果蝇心脏发育具有重要意义。从果蝇体内提取出总RNA,反转录得到果蝇的cDNA,将其作为模板PCR得到Hand基因部分片段,将片段连接到pET-28a上,构建重组质粒pET一28a—Hand,将重组质粒转化rosetta受体菌,IPTG诱导表达,表达产物经镍柱纯化,SDS—PAGE电泳分析,结果表明Hand基因在大肠杆菌中成功表达,表达的Hand融合蛋白分子量大约为24kD,经镍柱纯化后获得了高纯度可溶性的Hand蛋白。     

mLST8在大肠杆菌中的表达、纯化及鉴定

目的:表达并纯化mLST8蛋白。方法:PCR扩增mLST8的编码cDNA,克隆到pET-28a(+)表达载体,将重组质粒pET-28a-mLST8转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,在IPTG诱导下表达目的蛋白;提取包涵体,用Ni2+亲和层析纯化目的蛋白,稀释和透析相结合进行复性,对复性蛋白进行阴离子交换层析、分子筛层析,将纯的复性mLST8进行肽指纹质谱鉴定和圆二色谱分析。结果:酶切和DNA测序证明pET-28a-mLST8表达质粒构建无误,并在大肠杆菌中得到高效表达;通过Ni2+亲和层析、复性、离子交换层析和分子筛层析获得了较高纯度的复性蛋白,肽指纹质谱鉴定为mLST8;mLST8蛋白的二级结构[α螺旋为18.2%,β折叠为52.3%(其中平行结构为12.1%,反向平行结构为40.2%),β转角为20.7%,无规则卷曲为39.9%]表明其为典型的β折叠结构。结论:在大肠杆菌中表达了重组mLST8蛋白,复性获得了二级结构准确的mLST8,为进一步研究mLST8的晶体结构与功能奠定了基础。     

重组斑马鱼 p8蛋白的原核表达及纯化

目的：在大肠杆菌中重组表达斑马鱼p8蛋白并纯化。方法：PCR扩增斑马鱼p8蛋白基因编码区,连接到带有6×His标签的原核表达载体pET-28a中,构建重组表达质粒pET-28a-p8并转化大肠杆菌BL21（DE3）,用IPTG诱导表达;优化表达条件后用Ni^2＋柱纯化重组蛋白。结果：构建了pET-28a-p8重组质粒;目的蛋白在大肠杆菌中获得表达,亲和纯化后,SDS-PAGE显示相对分子质量为预期的12．8×10^3。结论：获得了斑马鱼p8融合蛋白,为其生物学功能研究奠定了基础。     

重组斑马鱼CD36蛋白的原核表达及纯化

目的：在大肠杆菌中重组表达斑马鱼CD36蛋白胞外区38～432氨基酸残基段并纯化。方法：PCR扩增斑马鱼CD36蛋白的基因编码区,连接到带有6~His标签的原核表达载体pET-28a中,构建重组表达质粒pET28a-CD36,并转化大肠杆菌BL21（DE3）,用IPTG诱导表达,优化表达条件后用Ni^2＋柱进行纯化。结果：构建了pET28a-CD36重组质粒;目的蛋白在大肠杆菌中获得表达,亲和纯化后,SDS-PAGE显示相对分子质量为预期的46．8×10^3。结论：获得了斑马鱼CD36融合蛋白,为其生物学功能研究奠定了基础。     

人PSF蛋白的原核表达及分析鉴定

PSF(polypyrimidine tract binding protein-associated splicing factor)蛋白是一种多功能的DNA/RNA结合蛋白,能够抑制原癌基因的表达,在人和小鼠中具有肿瘤抑制的作用.以人成纤维细胞总RNA为材料,利用PSF特异性引物通过RT-PCR的方法扩增得到PSF...     

植原体免疫主导膜蛋白Imp基因原核表达载体构建及表达

旨在构建植原体免疫主导膜蛋白Imp基因原核表达载体,并进行初步表达。以重组克隆质粒pMD18-T-Imp为模板,PCR扩增Imp基因片段。构建表达载体pET-28a(+)-Imp,转化宿主菌E.coliBL21(DE3)。筛选阳性克隆,提取重组质粒作PCR鉴定、酶切鉴定及IPTG诱导表达鉴定。PCR及双酶切结果显示,重组质粒pET-28a(+)-Imp构建成功。经IPTG诱导BL21(pET-28a(+)-Imp)表达约20 kD的蛋白,与预期的携带6×His-Tag的目的蛋白(19.5 kD)大小相符,主要以包涵体形式存在。结果显示,构建的表达载体pET-28a(+)-Imp在E.coliBL21(DE3)中能够达一定量表达,为进一步纯化Imp蛋白奠定基础。     

鼠肝炎冠状病毒非结构蛋白1及其突变体的原核表达

目的:构建鼠肝炎冠状病毒(MHV)非结构蛋白1(NSP1)及其突变体(NSP1 mu)的原核重组表达质粒,在大肠杆菌中分别融合表达重组NSP1及NSP1 mu。方法:以现有质粒载体为模板,扩增编码NSP1及NSP1 mu的基因片段,并克隆至pMD18-T克隆载体;菌落PCR鉴定阳性克隆并测序分析;将阳性克隆的目的片段亚克隆至表达载体pET-28a,并转化大肠杆菌TOP10感受态细胞,PCR和双酶切鉴定转化菌落;将阳性质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞并加入IPTG诱导表达,SDS-PAGE和免疫印迹分析目的蛋白的表达。结果:PCR扩增得到表达NSP1及NSP1 mu的特异片段,并克隆到pMD18-T载体,测序结果正确无误;构建了NSP1和NSP1 mu的重组表达质粒,并在大肠杆菌BL21(DE3)中分别融合表达了重组NSP1及NSP1 mu,表达的目的蛋白均能与His单克隆抗体特异结合;用Ni-NTA琼脂糖试剂盒纯化重组蛋白,获得可溶性的NSP1及NSP1 mu,相对分子质量分别为27×103和28×103。结论:在大肠杆菌中分别表达并纯化获得了大量可溶性重组NSP1及NSP1 mu。     

重组人磷脂爬行酶1的原核表达及纯化

目的:建立重组人磷脂爬行酶1(hPLSCR1)原核表达及纯化工艺。方法:PCR扩增hPLSCR1编码基因并连接到原核表达载体pET-28a,转化大肠杆菌BL21(DE3)并进行诱导表达,Western印迹鉴定所表达蛋白;优化表达条件后,Ni2+柱亲和层析纯化重组蛋白。结果:构建了pET-28a-PLSCR1重组质粒,诱导表达后,经SDS-PAGE分析目的蛋白的表达量达32%,Ni2+金属螯合法纯化目的蛋白后纯度达到95%以上,Western印迹验证了融合蛋白的特异性。结论:建立了高效稳定的His-PLSCR1表达体系,获得大规模生产His-PLSCR1的分离纯化工艺,为进一步研究其蛋白功能奠定了基础。     

克雷伯氏菌甘油脱氢酶dhaD的克隆表达、纯化及酶学性质研究

以克雷伯氏菌基因组DNA为模板,扩增得到编码甘油脱氢酶（GDH）的基因dhaD,将其克隆到大肠杆菌表达载体pET-28a(+)上,在E.coliBL21（DE3）中诱导表达,利用表达载体pET-28a(+)上的6·His-Tag标记选用Ni柱亲和层析法纯化表达具有活性的甘油脱氢酶(GDH),纯化后比酶活达到156U/mg,纯化倍数达4.6倍,回收率为67.4%。并初步研究了该酶的酶学性质,酶反应的最适pH为11.0,在pH7.0～12.0范围内稳定;酶反应的最适温度为30℃,稳定范围为25～45℃; 酶动力学参数以甘油为底物的Km为0.54 mmol/L, Vmax为0.49 μmol/(mL·min)。