庚型肝炎病毒包膜糖蛋白E2基因在昆虫细胞中的表达

用PCR扩增出HGV E2全基因,克隆进杆状病毒表达载体pFASTBACHTa中,构建成重组转座载体pFASTBAC-E2,转化DH10BAC大肠杆菌感受态细胞,筛选阳性菌落,抽提大分子质粒DNA,获得含HGV E2基因的重组杆状病毒穿梭载体,转染昆虫草地夜蛾Sf9细胞,出现细胞病变后,收集含有重组病毒颗粒的培养上清,重新感染草地夜蛾Sf9单层细胞及甜菜夜蛾幼虫,分别收集Sf9细胞和甜菜夜蛾幼虫体内的血淋巴细胞,进行12%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,可见表达的融合蛋白带,经亲和层析进行蛋白纯化,用ELISA方法检测各类血清标本,初步研究HGV E2糖蛋白的抗原性.     

人ING4的基因克隆及真核表达

目的克隆人生长抑制因子家族（inhibitor of growth famility member4,ING4）基因,构建其真核表达载体pEGFP—ING4。方法提取人胎盘总RNA,经RT—PCR扩增出ING4 cDNA,克隆至pEGFP—C2载体,构建的真核表达载体pEGFP—ING4用双酶切、基因测序进行序列鉴定;转染MCF-7细胞用荧光显微镜和免疫组化检测重组质粒的表达。结果RT—PCR产物为750bp的条带,双酶切和基因测序正确,转染可见目的蛋白融合表达。结论从人胎盘组织中成功克隆了ING4基因并构建其真核表达质粒在人MCF-7细胞中表达,为进一步研究1NG4基因的作用及抗肿瘤机制奠定了基础。     

APOBEC3F的克隆、真核表达及其抗HBV效应的初步研究

目的克隆、体外真核表达载脂蛋白BmRNA编辑酶催化多肽样3F（APOBEC3F）基因并研究其抗病毒效应。方法应用RT—PCR的方法从人PBMC细胞中扩增APOBEC3F基因,构建HA—APOBEC3F融合蛋白真核表达载体pXFA3F,pXFA3F和具有复制能力的1．3倍HBV载体pHBVl．3共转染HepG2细胞,Western印迹检测APOBEC3F融合蛋白在HepG2细胞中的表达,ELISA方法检测细胞培养上清液中的HBsAg和HBeAg水平,实时定量PCR检测HBV相关mRNA水平变化。结果克隆了APOBEC3F基因,其经测序与GeneBank公布序列一致;构建的APOBEC3F真核表达载体pXFA3F经转染可在HepG2细胞中瞬时表达;APOBEC3F可抑制乙型肝炎表面抗原和e抗原的分泌,可使转染细胞内HBV相关mRNA水平下降。结论成功克隆并真核表达了APOBEC3F基因,其在体外具有抗HBV生物学效应。     

67kD层粘连蛋白受体的克隆、表达及其对肝癌细胞侵袭能力的影响

探讨细胞膜表面 6 7kD层粘连蛋白受体 (6 7kDlamininreceptor ,6 7LR)在肝癌细胞侵袭转移中的作用 ,从肝癌细胞中提取RNA ,通过RT PCR扩增 6 7LR的前体——— 37kD层粘连蛋白受体前体(37kDlamininreceptorprecursor,37LRP)基因并定向克隆到真核表达载体pcDNA3.1 myc His(- )A ,采用脂质体将重组质粒转染到HepG2肝癌细胞中 ,通过G4 1 8筛选和RT PCR、流式细胞术鉴定 ,获得了细胞膜表面 6 7LR高表达 (阳性率为 6 9.2 % )和低表达 (阳性率为 1 1 .7% )的细胞克隆 ,采用体外细胞侵袭实验测定不同细胞的侵袭能力 ,发现膜表面 6 7LR高表达的细胞侵袭能力明显高于低表达及不表达细胞 ,说明 6 7LR在肝癌细胞侵袭转移过程中可能具有重要意义     

SCG10基因重组质粒的构建及蛋白表达和定位

目的构建SCG10真核表达载体并证实融合蛋白在细胞内表达及定位。方法以人胎脑cDNA文库为模板,PCR扩增SCG10全长编码基因,亚克隆至pEGFP-C1表达载体中。将构建的重组质粒测序并转染到人胚肾HEK293中,提取细胞蛋白进行Western blot检测。利用共聚焦激光扫描显微镜观察pEGFP-SCG10在HEK293细胞内定位。结果 SCG10全长基因序列克隆到了真核表达载体pEGFP-C1中,酶切鉴定片段大小540bp。Western blot检测到了融合蛋白表达,分子量约为48kD。pEGFP-SCG10在细胞内定位以细胞浆为主,在细胞核少量表达。结论成功构建了SCG10全长基因真核表达载体,pEGFP-SCG10蛋白主要定位于HEK293细胞浆内。     

K-Rasa^G12D基因突变体慢病毒载体的构建及其鉴定

目的：构建K-RasGl2D基因突变体慢病毒载体。方法：从病人组织中提取RNA通过RT—PCR反转录获得cDNA作为K-RasGl2D基因模板,通过PCR法扩增出K-RasGl2D基因突变体片段。将酶切的片段克隆入真核表达载体pCDH-CMV—MCS—EF1-RFP中,构建K-RasG12D基因突变体逆转录病毒真核表达载体。将连接产物转化至感受态大肠埃希菌DH5a,挑取转化平板上的细菌克隆,在抗生素培养液中培养过夜后进行PCR鉴定。经测序正确后转染293T细胞系,利用重组质粒PCR及串联基因表达的检测等方法对目的基因的转录与表达进行分析与鉴定。结果：所构建的K-RasGl2D突变体基因逆转录病毒真核表达载体经PCR鉴定和测序鉴定正确,转染293T细胞后可以观察到可检测到高强度表达的RFP荧光信号。结论：成功构建了重组真核表达载体,为下一步建立稳定转染细胞系及进一步研究K-Ras突变在癌症发病中的作用奠定了基础。     

RNA干扰VEGF对体外JAR细胞生长的影响

利用pSUPER质粒作为载体,在人绒癌JAR细胞内成功的沉默了VEGF基因的表达,建立了稳定转染pSUPER—shVEGF1,pSUPER—shVEGF2干扰质粒的JAR细胞株．随后利用RT—PCR证实了在JAR细胞株中,VEGF基因的表达被抑制．显微观察及流式细胞学检测转染后细胞株克隆生长情况显示体外培养条件下VEGF基因受抑后JAR细胞生长周期无发生变化,提示VEGF在体外可能对JAR细胞增殖无直接作用．     

构建骨骼肌特异表达人FS基因载体及其稳定转染绵羊胎儿成纤维细胞

旨在构建骨骼肌特异表达人卵泡抑制素( follistatin,Fs)基因载体并得到其稳定转染的蒙古绵羊胎儿成纤维细胞系,为后期通过体细胞核移植方法制作转FS基因克隆绵羊奠定基础.首先通过RT-PCR方法克隆得到人FS基因cDNA序列,然后与猪骨骼肌特异表达启动子α-actin以及红色荧光蛋白表达元件连接,构建成FS基因骨骼肌特异表达载体pCFCDS.脂质体介导外源表达载体转染绵羊胎儿成纤维细胞,经G418筛选后得到稳定转染的绵羊转基因细胞克隆.PCR鉴定外源基因在细胞基因组中的整合,分析转基因细胞系的核型和生长状况.结果显示,成功构建得到绵羊骨骼肌特异表达人FS基因的真核表达载体,并得到其稳定转染的转基因绵羊胎儿成纤维细胞系,为后期通过体细胞核移植方法制作转FS基因克隆绵羊奠定基础.     

小干扰RNA对庚型肝炎病毒基因在人Huh-7细胞中表达的抑制作用

RNA干扰(RNAi)是由小干扰RNA(siRNA)引发的生物细胞内同源基因的转录后基因沉默现象, 是近年来兴起的一项研究生物基因调控与功能的崭新技术. 庚型肝炎病毒(HGV)是一单正链RNA病毒, 复制时不与宿主细胞基因组整合, 尤其适合用于RNAi的研究. 构建了含HGV完整结构基因并携带筛选标志潮霉素基因的真核表达载体pVAX.EH, 转染Huh-7细胞后, 筛选获得稳定表达HGV 结构蛋白的Huh-7细胞株(Huh-7-EH). RT-PCR和Western blot检测证实, HGV结构基因能在Huh-7-EH细胞中转录、表达, 并能进行剪切和翻译后修饰. 以体外转录法制备了2对靶向HGV E2基因的siRNA(1-E2 siRNA和2-E2 siRNA), 将其导入Huh-7-EH细胞中, 采用Western blot和克隆形成实验证实, HGV 1-E2 siRNA和2-E2 siRNA均能特异性抑制HGV结 构蛋白的表达, 抑制作用可维持1周以上. 其中2-E2 siRNA的抑制作用更强, 转染后对Huh-7-EH细胞潮霉素抗性克隆形成的抑制率达到了99%. Huh-7-EH细胞转染siRNA后对潮霉素敏感, 说 明HGV E2 siRNA不仅使HGV E2区的mRNA降解, 还可使融合在HGV E2区下游的潮霉素mRNA降解. 综上所述, 本实验建立的稳定表达HGV结构蛋白的Huh-7-EH细胞株, 能作为用于研究HGV复制和RNAi的细胞模型; HGV结构基因区的siRNA可同时抑制HGV结构蛋白及其下游的潮霉素基因的表达, 证明RNAi在真核细胞Huh-7-EH内可能存在放大作用.     

USP22基因克隆及其融合蛋白真核表达载体的构建

目的克隆人类泛素水解酶22（ubiquitin—specific processing enzyme22,USP22）基因,构建与绿色荧光蛋白融合表达的真核载体。方法利用RT—PCR技术以HeLa细胞总RNA为模板分别扩增USP22基因cDNA序列两片段,依次插入真核表达载体pEGFP—N1;重组质粒转染HEK293T细胞,观察融合蛋白表达及绿色荧光的分布。结果测序结果显示USP22序列与GenBank收录数据一致,酶切显示重组质粒pEG—FP—USP22构建无误,质粒转染后有80％左右HEK293T细胞表达绿色荧光,且在胞质与胞核中广泛分布。结论成功克隆USP22基因并构建与GFP融合表达的真核载体,为进一步深入研究USP22基因的生物学功能奠定了基础。     

人白细胞抗原G3在稳定转染细胞细胞膜上的表达

人白细胞抗原G(HLA G)是一种在母婴耐受中起主要作用的非经典的HLA Ⅰ类分子 .其中HLA G3结构简单 ,仅具有α1结构域、穿膜区及胞浆区 ,其是否在细胞表面表达尚存在争议 .为了建立HLA G3稳定转染细胞株并确定其在细胞内的定位 ,采用RT PCR法从 9周人胎盘组织中获得了HLA G3的cDNA ,并构建到真核表达载体pcDNA3中 ,将所获得的真核表达质粒pcDNA G3转染至HLA Ⅰ (- )细胞株K5 6 2 ,经G4 18筛选后获得稳定转染的细胞株K5 6 2 G3.利用RT PCR、Western印迹检测方法证明在K5 6 2 G3细胞株中 ,HLA G3在mRNA水平和蛋白水平上均有表达 .进一步利用免疫荧光标记技术 ,证明HLA G3能够在转染细胞细胞膜上表达 .结果表明 ,稳定转染细胞株中HLA G3蛋白能够定位表达在细胞膜     

HGV RNA基因组感染HepG2细胞的研究

为了观察HGV RNA基因组在HepG2细胞中的复制和表达并建立HGV感染的细胞模型,体外转录制备HGV RNA基因组,Lipfectamin介导转染HepG2细胞。取HGV RNA阳性培养上清液传代感染HepG2细胞,采用RT-PCR、免疫组化和Western blot等技术检测HGV在HepG2细胞中的复制和表达。HepG2细胞地转染后24h便可在培养上清液中检测到HGV负链RNA,传代感染的细胞及培养上清液中可检测到HGV正、负链RNA。在90d内传代20余次,均能检测到HGV的复制。免疫组化和Western blot可检测到 HGV E2蛋白在感染细胞中的表达。HGV感染细胞经冻存后复苏,仍能检测到HGV RNA。故HGV RNA基因组能够在HepG2细胞中复制和表达,此细胞模型有可能用于HGV的复制与感染防治的研究。     

人血小板生成素重组载体的构建与体外表达

应用基因克隆技术,以人ＴＰＯｃＤＮＡ为目的基因,构建真核细胞表达重组体ＶＲＴＰＯ,藉脂质体将其转染于ＮＩＨ３Ｔ３细胞,应用ＰＣＲ、ＲＴ－ＰＣＲ及Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹等技术对其转染及表达情况进行鉴定．结果表明：ＶＲＴＰＯ构建成功,在ＮＩＨ３Ｔ３细胞可表达人ＴＰＯ,为应用人ＴＰＯｃＤＮＡ进行质粒ＤＮＡ骨骼肌直接注射于动物体内的基因治疗研究奠定了基础     

野生型和突变型p16在H460细胞株的表达

应用ＰＣＲ体外定点突为技术,构建了ｐ１６－Ｐ４８Ｌ和ｐ１６－Ｄ７４ｎ突变体。野生型和突变型ｐ１６ｃＤＮＡ克隆地ｐｃＤＮＡ３真核表达载体,导入纯合缺失ｐ１６基因的人肺癌细胞株Ｈ４６０,经ＲＮＡ点杂交初筛吴Ｇ４１８抗性的细胞株,再用Ｎｏｒｔｈｅｒｎ印迹证实外源ｐ１６表达。     

应用cDNA微阵列技术研究EB病毒LMP1介导的鼻咽癌中转移相关基因的表达

探讨EB病毒基因组编码的癌蛋白LMP1对鼻咽癌细胞中转移相关基因表达的影响.采用蛋白质印迹法检测在强力霉素(Dox)诱导下,鼻咽癌细胞系pTet-on-LMP1 HNE2(L7细胞)中LMP1表达的时效和量效关系.应用cDNA微阵列技术建立诱导性LMP1介导鼻咽癌细胞中转移相关基因差异表达谱;运用RT-PCR验证cDNA微阵列筛选差异基因表达的可靠性.与LMP1不表达的L7细胞比较,LMP1高表达的L7细胞中7个基因的表达显著上调,12个基因的表达显著下调.随机选择其中4个基因进行RT-PCR,结果显示,这些基因表达阳性,且与微阵列中的变化趋势一致.LMP1可能通过激活和/或抑制一些转移相关基因的表达而参与鼻咽癌转移过程.     

禽流感病毒HA基因真核表达质粒的构建与表达

血凝素蛋白（HA）基因是禽流感病毒（AIV）重要的保护性抗原基因.为了研究 HA基因疫苗,用PCR扩增H5亚型AIV HA基因,将其克隆到质粒pcDNA4/HisMax和pRc/CMV上得到真核表达质粒pC4H5和pCMVH5.采用Tfx^TM-20、Superfect转染试剂和电转染法转染HeLa细胞,转染后的HeLa细胞经蛋白质印迹和血凝试验检测HA蛋白及其活性.结果表明,Superfect转染和电转染均能正确表达HA蛋白并具有生物学活性,蛋白质印迹检测到HA和HA裂解的HA1和HA2,与AIV 的HA、HA1、HA2蛋白的分子质量一致.从血凝试验结果看,Superfect和电转染表达的HA均具有血凝活性,而经Superfect转染的pC4H5的表达量是pCMVH5的8倍,表明pC4H5是一高效的真核表达质粒.     

黄瓜花叶病毒cDNA载体在烟草细胞中表达外源基因

为了探讨利用黄瓜花叶病毒(CMV)构建表达载体的可行性,分离了山东株(SD) CMV RNA 3的全长cDNA。测定其全序列后,采用定点突变的方法在衣壳蛋白(CP)基因起始密码子处改造出一个NsiⅠ位点,可将外源基因引入NsiⅠ位点和CP基因终止密码子上游附近的XhoⅠ或SalⅠ位点而置换掉CP基因。分别用绿色荧光蛋白(GFP)基因、β-葡糖醛酸酶(GUS)基因以及小鼠二氢叶酸还原酶(DHFR)基因3种报告基因置换CP基因。将Fny株CMV RNA 1、RNA 2和SDCMV嵌合RNA 3的cDNA分别插入pCass载体的35S启动子和终止子之间,将构建的置换型载体直接以质粒的方式转染烟草原生质体,表达了3种报告基因。     

Cloning and expression of MyoG gene from Hu sheep and identification of its myogenic specificity

This experiment was conducted to explore the biological functions of myogenin (MyoG) gene. MyoG gene was cloned from genome of Hu sheep by overlap extension PCR. Then, pEGFP-C1–MyoG and pcDNA3.0–MyoG fusion expression vectors was constructed and pEGFP-C1–MyoG vector had been transfected into NIH-3T3 cells by liposomes-mediated method, and MyoG was detected in vitro by RT-PCR,western blotting and its subcellular localization by EGFP marker. pcDNA3.0–MyoG was transfected into goat embryonic fibroblasts (GEF) cells in order to detect the myogenic function of MyoG in vitro. Then pEGFP-C1–MyoG plasmid was injected into the testes of sheep and goat, respectively, to produce the transgenic generation. The results showed that the length of MyoG coding region of Hu sheep was 675 bp, encoding 224 amino acids. Compared with goat, cattle, pig and rat, the sequence homology of sheep MyoG cDNA was 99.26, 97.04, 92.00, and 87.70 %, respectively. The bioinformatics prediction showed that MyoG protein contained a typical bHLH structure, but without a short signal peptide, revealing that MyoG protein might be a non-secretory protein. The result of RT-PCR and western blotting demonstrated that MyoG could be expressed successfully in the transfected cells in vitro and the MyoG protein was located in nucleus. The positive transfected GEF cells with pcDNA3.0–MyoG were found to express desmin protein. The positive rates of transgenic sheep and transgenic goat were 7.1 and 7.4 % in F1 generation, respectively. Conclusively, MyoG cDNA from Hu sheep had been cloned successfully. The subcellular localization and myogenic activity of MyoG were exactly detected on the basis of multiple biological analyses, which expanded our understanding of the biological function of MyoG.