果蝇唾液腺特异基因CG8419多克隆抗体的制备及检测

果蝇CG8419基因与脊椎动物中TRIM45基因为同源基因.以果蝇cDNA为模板通过PCR扩增出亲水性和特异性好的果蝇CG8419基因片段,将其克隆入表达载体PET-28a,构建出重组表达质粒PET-28a-CG8419.将重组质粒转化大肠杆茵Rosetta,经IPTG诱导出带His标签的重组融合蛋白.通过尿素洗涤包涵体并切胶回收纯化融合蛋白,然后再免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体.Western blot实验分别验证抗体的效价和特异性.果蝇胚胎抗体染色显示该基因在果蝇唾液腺中表达.     

果蝇心脏发育标记基因Kruppel的多克隆抗体制备

Kruppel在果蝇发育过程中起着重要的调控作用。为了进一步研究Kruppel的功能,需要制备Kruppel蛋白及其抗体.对已有的Kruppel序列进行分析,选取适当区域进行引物设计,从果蝇心脏cDNA文库中PCR扩增得到Kruppel部分编码区序列,并其连接到pET-28a载体上。将重组质粒（pET-28a-Kruppel）转化rosetta受体菌,通过IPTG（Isopropylβ-D-thiogalactoside）诱导表达融合蛋白,用镍柱进行亲和纯化。将纯化得到的融合蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,并用Western blot检测抗体的效价。     

果蝇心脏发育标记基因lbe的多克隆抗体制备

lbe是已经证明的心脏标记基因。为了深入研究lbe在心脏发育中的功能,需要获得lbe蛋白并制备其抗体。首先提取野生型成体果蝇的总RNA,反转录获得其cDNA文库,通过PCR克隆出lbe编码区序列,将其连接到pET-28a原核表达载体上。经酶切及测序鉴定后,质粒构建成功。将重组质粒（pET-28a-lbe）转化大肠杆菌菌株Rosseta,用IPTG诱导表达出融合蛋白,经Ni-IDA凝胶柱纯化后,最后将纯化的融合蛋白免疫新西兰大白兔制备lbe多克隆抗体,并用Western blotting检测抗体的效价和特异性。结果显示获得了lbe原核表达重组融合蛋白及高效价的特异性兔抗lbe多克隆抗体,为lbe功能的进一步研究奠定了基础。     

静水椎螺乙酰胆碱结合蛋白在Bac-to-Bac系统中的表达、纯化与结晶

表达、纯化静水椎螺(Lymnaea stagnalis)乙酰胆碱结合蛋白(Ls-AChBP)并得到晶体。将静水椎螺乙酰胆碱结合蛋白cDNA序列克隆到表达载体pFastBac1上,构建了重组表达质粒pFastBac1-Ls-AChBP-His,经重组子筛选,得到重组杆状病毒质粒Bacmid,采用CellfectinⅡ脂质体,把带有外源基因的杆状病毒质粒Bacmid转染到昆虫细胞中,经镍柱和凝胶色谱柱对重组蛋白进行纯化得到五聚体,并用机器人进行结晶筛选获得其蛋白晶体。重组蛋白Ls-AChBP在Bac-to-Bac表达系统中得到高效表达并被纯化,结晶筛选得到晶体。     

拟南芥中柯浩体蛋白Atcoilin的克隆、表达及纯化

旨在制备柯浩体的标志蛋白——Atcoilin蛋白,利用pET-28a与目的基因构建重组表达质粒,经DNA测序证实插入序列与设计完全一致后,将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG进行诱导表达,产物用SDS-PAGE及Western blotting分析鉴定。通过分别改变IPTG的浓度、培养时间、培养温度等来优化Atcoilin蛋白的表达条件。表达出的重组蛋白经过镍柱、分子筛进行纯化。结果显示,原核表达载体pET28a-At1g13030成功构建,可在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,得到相应的重组蛋白经Western blotting鉴定正确。在IPTG浓度为0.7 mmol/L,18℃培养20 h的条件下,目的蛋白表达量最高。经过SDS-PAGE分析鉴定,过镍柱、分子筛后得到的重组蛋白纯度较高。     

小鼠CSRP2基因的克隆、融合表达及蛋白的分离纯化

目的：获得小鼠CSRP2（cysteine rich protein2）基因片段,高效表达、纯化CSRP2。方法：用RT-PCR技术从小鼠心脏组织中提取总DNA并扩增出相应大小的CSRP2DNA片段,将其与pGEM—T—easy载体连接后测序,将测序正确的CSRP2从BamHⅠ和HindⅢ酶切位点克隆入原核表达载体pRSET—A,将连接产物转化大肠杆菌BL21,挑出阳性克隆,IPTG诱导表达重组的6xHis融合蛋白,对重组融合蛋白通过镍柱进行纯化。结果与结论：PCR获得的C职咫序列与GenBank报道的一致（为675bp）;重组载体在大肠杆菌BIJ21中以包涵体形式高效表达;融合蛋白经SDS—PAGE和Western blot分析,在相对分子质量约24×10^3处有特异的蛋白条带,目的蛋白表达量占菌体总蛋白量的25％;重组蛋白经镍柱纯化后,得到了高纯度的CSRP2融合蛋白。     

热玫瑰小双孢菌来源的丙酮酸磷酸双激酶的表达及应用

以热玫瑰小双孢菌基因组DNA为模板, 通过PCR扩增得到了编码PPDK的基因, 将此基因片段插入到表达载体pET28a(+)中构建得到了重组表达质粒pET28a(+)-PPDK, 将重组表达质粒pET28a(+)-PPDK转化到大肠杆菌BL21(DE3)中, 经过IPTG诱导, 重组菌成功表达了N端带有6-His Tag的重组PPDK。经SDS-PAGE分析, 重组PPDK单体分子量为101 kD。经过镍亲和层析和超滤后, 重组PPDK蛋白基本达到电泳纯, 并被成功应用于焦测序中。     

热玫瑰小双孢菌来源的丙酮酸磷酸双激酶的表达及应用

以热玫瑰小双孢菌基因组DNA为模板, 通过PCR扩增得到了编码PPDK的基因, 将此基因片段插入到表达载体pET28a(+)中构建得到了重组表达质粒pET28a(+)-PPDK, 将重组表达质粒pET28a(+)-PPDK转化到大肠杆菌BL21(DE3)中, 经过IPTG诱导, 重组菌成功表达了N端带有6-His Tag的重组PPDK。经SDS-PAGE分析, 重组PPDK单体分子量为101 kD。经过镍亲和层析和超滤后, 重组PPDK蛋白基本达到电泳纯, 并被成功应用于焦测序中。     

幽门螺杆菌CagA蛋白N端片段的表达、纯化及其与磷脂酰丝氨酸的亲和力检测

目的:表达和纯化幽门螺杆菌不同菌株的CagA蛋白N端片段,检测其与磷脂酰丝氨酸(PS)的相互作用及亲和力。方法:用PCR方法从幽门螺杆菌3个菌株中扩增出CagA蛋白N端基因,并连接到表达载体pET-28a上;转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导可溶性表达CagA蛋白N端880残基片段;经镍柱亲和纯化后,利用PLOA法检测CagA蛋白与PS的相互作用。结果:构建了3种幽门螺杆菌菌株cagA基因的原核表达质粒pET-28a/cagAJ99、pET-28a/cagA11637及pET-28a/cagASS1,并在大肠杆菌中获得可溶性表达,SDS-PAGE和Western印迹证实得到目标融合蛋白,亲和纯化得到高纯度CagA蛋白。PLOA结果表明,CagA蛋白与PS有明显的相互作用。结论:3种幽门螺杆菌菌株CagA蛋白与PS之间存在相互作用,且不同的CagA与PS有不同的亲和力。     

人源酪蛋白激酶Ⅱ催化亚基的构建及表达纯化

目的:构建人源CK2催化亚基pET-28a(+)-hcsnk2a1和pET-28a(+)-hcsnk2a2重组质粒,并进行原核表达纯化得到高纯度融合蛋白,为进一步开展CK2生理病理机制研究以及CK2作为肿瘤抑制靶点相关抑制剂的筛选和评价提供实验基础。方法:利用合成的人源csnk2a1和csnk2a2目的基因片段,将酶切连接得到的重组质粒经测序验证后,进行大肠杆菌感受态BL21 (DE3)/Transetta (DE3)转化。使用合适浓度IPTG诱导融合蛋白的表达以得到可溶性的融合蛋白,并应用AKTA avant蛋白纯化仪和Ni2+-NTA预装柱进行纯化,蛋白纯度最后经SDS-PAGE胶分离后考马斯亮蓝染色和Western Blot检测鉴定。结果:测序结果表明pET-28a(+)-hcsnk2a1和pET-28a(+)-hcsnk2a2质粒均成功被构建;经转化诱导表达后,成功纯化得到相对分子量为42KD的his-hcsnk2a1和38KD的his-hcsnk2a2目的融合蛋白。结论:首次成功构建得到pET-28a(+)-hcsnk2a1和pET-28a(+)-hcsnk2a2质粒;并表达纯化得到高浓度和高纯度的his-hcsnk2a1和his-hcsnk2a2融合蛋白,为后期的蛋白功能研究和抑制剂筛选评价提供了基础。     

植原体免疫主导膜蛋白Imp基因原核表达载体构建及表达

旨在构建植原体免疫主导膜蛋白Imp基因原核表达载体,并进行初步表达。以重组克隆质粒pMD18-T-Imp为模板,PCR扩增Imp基因片段。构建表达载体pET-28a(+)-Imp,转化宿主菌E.coliBL21(DE3)。筛选阳性克隆,提取重组质粒作PCR鉴定、酶切鉴定及IPTG诱导表达鉴定。PCR及双酶切结果显示,重组质粒pET-28a(+)-Imp构建成功。经IPTG诱导BL21(pET-28a(+)-Imp)表达约20 kD的蛋白,与预期的携带6×His-Tag的目的蛋白(19.5 kD)大小相符,主要以包涵体形式存在。结果显示,构建的表达载体pET-28a(+)-Imp在E.coliBL21(DE3)中能够达一定量表达,为进一步纯化Imp蛋白奠定基础。     

西藏株小反刍兽疫病毒H蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备

【背景】小反刍兽疫是由小反刍兽疫病毒(Peste des petits ruminants virus,PPRV)引起的一种急性、烈性、接触性传染病,严重威胁我国养羊业的发展。【目的】原核表达PPRVH蛋白,并制备其多克隆抗体。【方法】根据GenBank中PPRV西藏株h基因序列,对其进行密码子大肠杆菌偏爱性优化,采用两步PCR法全化学合成全长h基因。将测序验证正确的h基因克隆至原核表达载体pET-28a、pET-30a、pET-32a,转化E. coli BL21(DE3)并利用IPTG诱导H蛋白表达。以经SDS-PAGE割胶纯化的重组H蛋白免疫新西兰大白兔制备抗PPRV H蛋白多克隆抗体。【结果】重组E. coli [pET-28a(-30a,-32a)-H]表达的重组H蛋白相对分子质量分别约为70、68和86 kD;诱导7 h时PRRV H蛋白表达量最高,而且主要以包涵体形式表达;重组E.coli(pET-30a-H)表达的H蛋白经SDS-PAGE割胶纯化后免疫新西兰大白兔制备的多抗血清能与表达的重组H蛋白发生特异性反应;ELISA法检测抗体效价在1:6400-1:25600之间。【结论】原核表达了PPRVH蛋白,并制备了高效价的抗H蛋白多克隆抗体,为进一步研究PPRV H蛋白的功能及H蛋白的线性B细胞表位作图奠定了基础。     

人PSF蛋白的原核表达及分析鉴定

PSF(polypyrimidine tract binding protein-associated splicing factor)蛋白是一种多功能的DNA/RNA结合蛋白,能够抑制原癌基因的表达,在人和小鼠中具有肿瘤抑制的作用.以人成纤维细胞总RNA为材料,利用PSF特异性引物通过RT-PCR的方法扩增得到PSF...     

鼠肝炎冠状病毒非结构蛋白1及其突变体的原核表达

目的:构建鼠肝炎冠状病毒(MHV)非结构蛋白1(NSP1)及其突变体(NSP1 mu)的原核重组表达质粒,在大肠杆菌中分别融合表达重组NSP1及NSP1 mu。方法:以现有质粒载体为模板,扩增编码NSP1及NSP1 mu的基因片段,并克隆至pMD18-T克隆载体;菌落PCR鉴定阳性克隆并测序分析;将阳性克隆的目的片段亚克隆至表达载体pET-28a,并转化大肠杆菌TOP10感受态细胞,PCR和双酶切鉴定转化菌落;将阳性质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞并加入IPTG诱导表达,SDS-PAGE和免疫印迹分析目的蛋白的表达。结果:PCR扩增得到表达NSP1及NSP1 mu的特异片段,并克隆到pMD18-T载体,测序结果正确无误;构建了NSP1和NSP1 mu的重组表达质粒,并在大肠杆菌BL21(DE3)中分别融合表达了重组NSP1及NSP1 mu,表达的目的蛋白均能与His单克隆抗体特异结合;用Ni-NTA琼脂糖试剂盒纯化重组蛋白,获得可溶性的NSP1及NSP1 mu,相对分子质量分别为27×103和28×103。结论:在大肠杆菌中分别表达并纯化获得了大量可溶性重组NSP1及NSP1 mu。     

重组斑马鱼 p8蛋白的原核表达及纯化

目的：在大肠杆菌中重组表达斑马鱼p8蛋白并纯化。方法：PCR扩增斑马鱼p8蛋白基因编码区,连接到带有6×His标签的原核表达载体pET-28a中,构建重组表达质粒pET-28a-p8并转化大肠杆菌BL21（DE3）,用IPTG诱导表达;优化表达条件后用Ni^2＋柱纯化重组蛋白。结果：构建了pET-28a-p8重组质粒;目的蛋白在大肠杆菌中获得表达,亲和纯化后,SDS-PAGE显示相对分子质量为预期的12．8×10^3。结论：获得了斑马鱼p8融合蛋白,为其生物学功能研究奠定了基础。     

CTX-M-3型超广谱β-内酰胺酶的表达、纯化及多克隆抗体的制备

目的 将肺炎克雷伯菌所产CTX-M-3型超广谱β-内酰胺酶(extended-spectrum β-lactamase,ESBLs)进行表达、纯化及其多克隆抗体的制备.方法 将保存的重组质粒pET-28a(+)/CTX-M-3在大肠埃希菌BL21( DE3)中原核表达.IPTG诱导CTX-M-3融合蛋白表达,利用镍琼脂糖凝胶亲和柱层析纯化蛋白,用纯化的CTX-M-3型ESBLs酶蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体.结果 可溶性检测表明表达产物以可溶性形式(上清中)和包涵体形式(沉淀中)两种形式存在.通过蛋白表达条件的优化实验,SDS-PAGE电泳结果显示18℃,0.8 mmol/L IPTG诱导24 h的CTX-M-3重组蛋白的可溶性表达最佳.SDS-PAGE电泳和Western-blot检测表明获得纯化的重组32 kD蛋白.免疫获得的CTX-M-3型ESBLs酶蛋白抗血清的效价为1∶32.结论 pET-28a(+)/CTX-M-3表达载体在大肠埃希菌BL21( DE3)中表达,用His亲和层析柱纯化可获得高纯度可溶性的重组蛋白,成功制备了效价较高的抗CTX-M-3型ESBLs酶蛋白多克隆抗体.     

小鼠附睾分泌的防御素Defb48的原核表达及纯化

目的:获取小鼠附睾分泌的防御素Defb48的基因并原核表达、纯化,为研究其功能奠定基础。方法:提取小鼠附睾组织的总RNA,用RT-PCR技术扩增出不含信号肽的Defb48编码序列,将2段Defb48编码序列串联克隆至原核表达载体pET28(a)中,经酶切和测序鉴定正确的重组质粒转化大肠杆菌Rosetta(DE3),IPTG诱导表达重组蛋白;用镍柱进行重组蛋白的纯化,然后进行SDS-PAGE和Western印迹分析鉴定。结果:获得实验所需小鼠附睾分泌的防御素Defb48的基因序列,测序结果与已发表的基因序列一致;在大肠杆菌Rosetta(DE3)中表达了His-Defb48融合蛋白,经Western印迹分析,在相对分子质量18 000处有特异的蛋白条带,镍柱纯化后获得纯度较好的融合蛋白。结论:克隆了小鼠附睾分泌的防御素Defb48基因,并在大肠杆菌Rosetta(DE3)中表达纯化出融合蛋白,为制备其多克隆抗体,进而进一步研究Defb48的功能奠定了基础。     

重组人磷脂爬行酶1的原核表达及纯化

目的:建立重组人磷脂爬行酶1(hPLSCR1)原核表达及纯化工艺。方法:PCR扩增hPLSCR1编码基因并连接到原核表达载体pET-28a,转化大肠杆菌BL21(DE3)并进行诱导表达,Western印迹鉴定所表达蛋白;优化表达条件后,Ni2+柱亲和层析纯化重组蛋白。结果:构建了pET-28a-PLSCR1重组质粒,诱导表达后,经SDS-PAGE分析目的蛋白的表达量达32%,Ni2+金属螯合法纯化目的蛋白后纯度达到95%以上,Western印迹验证了融合蛋白的特异性。结论:建立了高效稳定的His-PLSCR1表达体系,获得大规模生产His-PLSCR1的分离纯化工艺,为进一步研究其蛋白功能奠定了基础。     

人结合珠蛋白cDNA 克隆及其在大肠杆菌中的表达和鉴定

目的：克隆人结合珠蛋白（haptoglobin,Hp）cDNA ,并在大肠杆菌中表达和鉴定。方法：从Hela 细胞中分离总RNA,采用RT-PCR 方法获得人Hp cDNA,分别克隆至原核表达载体pET-32a和PGEX-4T-1,转化至大肠杆菌BL21,IPTG 诱导表达,并进行SDS-PAGE 及Western blot 鉴定。结果: 成功构建了高效原核表达质粒PET-32a-Hp 和PGEX-4T1-Hp;Western 印迹结果表明,经IPTG 诱导,在大肠杆菌中表达了分子量约30 kD和37 kD 的目的蛋白;表达产物经Ni2+-NTA 离子交换树脂纯化, 纯度>90%。结 论：在E.coli成功表达和纯化了人Hp 融合蛋白,为进一步开发人Hp 诊断试剂打下基础。