头状轮生链霉菌谷氨酰胺合成酶的研究 Ⅱ.酶的性质和调节

头状轮生链霉菌(Streptoverticillium caespitosus)谷氨酰胺合成酶(Glutamine synthetase,GS)生物活性的最适pH为7。测活系统中必须加入Mn~(2 )或Mg~(2 ),二者分别作激活离子时得到的酶的参数不同。Mn~(2 )对GS有稳定作用。一些金属离子如Ca~(2 )等强烈地抑制生物活性。GS的最适温度为50℃,对ATP、谷氨酸和NH_4Cl的Km值分别为1.75、2.78和5mmol/L。NH_4Cl的浓度小于10mmol/L时对酶有正协同效应,大于10mmol/L时对酶有负协同效应。GS可被氨阻遏,比活能被硝酸盐促进。一些代谢物对GS有累积反馈抑制作用。发酵过程中加入氨后无“氨休克”现象,高氨条件下的GS不受蛇毒磷酸二酯酶(SVPDE)的作用,所以此酶无腺苷酰化—去腺苷酰化调节。     

黄杆菌(Flavobacterium sp.)几丁质酶的纯化和性质

黄杆菌(Flavobacteium sp.)在几丁质的诱导下产生几丁质酶.通过(NH_4)_2SO_4沉淀、DEAE纤维素柱层析、Sephacryl 300柱层析及Sephadex G-75柱层析,从Flavobacterium sp.培养上清液中分离纯化了几丁质酶.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)纯度分析表明,纯化后的几丁质酶达到了均一的程度.用SDS-PAGE测得该酶的分子量约45D00道尔顿.该酶水解几丁质的最适pH为 7.0,最适温度为50℃,-20C贮存两年以上仍有活性.水解几丁质的Km值为5.0mg/ml.金属离子对几丁质酶活性影响较大,Ca~(2+) 、Co~(2+)’和Cu~(2+)对酶有激活作用.而NH_4~-、Ba~(2+)、Mg~(2+)、Mn~(2+)对酶有抑制作用.几丁质酶水解几丁质的产物是几丁质二糖.     

头状轮生链霉菌谷氨酰胺合成酶的研究 Ⅰ.酶的生成和纯化

以氨为氮源培养头状轮生链霉菌(Streptoverticillium caespitosus)时粗抽提液中谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase, GS)对热稳定,以硝酸盐为氮源时GS对热不稳定。以硫酸链霉素沉淀、热处理、聚乙烯亚胺(PEI)沉淀和Affini-gel Blue柱纯化了前者,以DE-52柱和Affini-gel Blue柱纯化了后者,纯化后两个酶分子量同为550000,亚基分子量同为56000,热稳定性相同,转谷氨酰基酶活力的最适pH均在6.4～6.7之间,对谷氨酰胺的K_m值同为11.1mmol/L,寸羟胺的K_m值同为1.6mmol/L,所以认为此菌中总是同一GS表现出活力。     

Mn2+浓度对地衣芽孢杆菌产不同构型聚-γ-谷氨酸机理分析

【目的】分析Mn~(2+)对地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)WBL-3产不同比例聚-γ-谷氨酸(γ-PGA)的机理。【方法】以枯草芽孢杆菌(B.subtilis)KH-2为对照菌株,克隆表达L-谷氨酸和D-谷氨酸代谢关键酶,分别为谷氨酸消旋酶(GR)、D-丙氨酸转氨酶(D-DDT)和谷氨酰胺合成酶(GS)。通过体外酶活实验与体内转录水平分析,初步探讨Mn~(2+)浓度对不同比例γ-PGA的生成机理。【结果】当Mn~(2+)浓度为0与0.6 mmol/L时,γ-D-PGA所占的比例分别为22%和67%。在0.6 mmol/L Mn~(2+)浓度下,B.licheniformis WBL-3中GR的催化活性(k_(cat)/K_m值)比未添加Mn~(2+)时高,GS只有在Mn~(2+)存在下才具有催化活性。实时荧光定量PCR结果表明,Mn~(2+)提高了GR、D-DDT和GS的转录水平,提高倍数分别为2.16、4.44和1.84倍。【结论】Mn~(2+)激活了GR、D-DDT与GS的表达,促进L-谷氨酸的代谢,使得菌体内D-谷氨酸比例升高,从而提高了γ-D-PGA的比例。     

3-氰基吡啶水合酶的纯化及性质

马红球菌(Rhodococcus equi)SHB-121胞内3-氰基吡啶水合酶经硫酸铵分级沉淀、DEAE-cellulose DE52和羟基磷灰石柱层析并经过Sephadex G-25处理,得到了聚丙烯酰胺凝胶电泳均一的3-氰基吡啶水合酶,纯化了31倍。该酶由一条肽链组成,其分子量为30kD,等电点为4.1。3-氰基吡啶水合酶能催化3-氰基吡啶水合生成尼克酰胺。酶反应最适pH为8.0,最适温度为30℃。Ag~+、Hg~(2+)、Cu~(2+)及NH_4~+对酶活力有强烈抑制作用。当以3-氰基吡啶为底物时,其K_m为0.1mol/L。NaCN为该酶反竞争性抑制剂,其K_I为5mmol/L。     

3-氰基吡啶水合酶的反应条件及影响因子

研究了芳腈水合酶催化水合3-氰基吡啶生成尼克酰胺的反应条件及影响因子.酶反应的最适pH为8.0,最适温度为25℃.酶在pH8.5于25℃保温4小时或在25—30℃于pH8.0保温3小时是稳定的.反应液中加入Fe~(3+)(1.5 mmol/L)可使酶活力增加 50%,而加入NH_4~+(300 mmol/L)则使酶活降低了67%.Ag~+和 Hg(2+)”强烈地抑制酶反应活性,在浓度均为 5mmol/L时,抑制率分别为99.7%和100%.NaCN(50 mmol/L)和苯甲腈(100 mmol/L)对酶活性的抑制率分别为78%和85%.该酶作用于 3-氰基吡啶的Km为62.5 mmol/L,V_(max)为85.8 μmol·min~(-1)·mg~(-1).     

谷氨酰胺合成酶在固氮鱼腥藻固氮调节中的作用

在MSX(methlonine sulfoximine,谷氨酰胺合成酶的不可逆抑制剂)存在下,固氮鱼腥藻(Anabaena azotica)所分泌的氨量和谷氨酰胺合成酶(GS)活力有较好的负相关性,证明谷氨酰胺合成酶-谷氨酸合成酶(GS-GOGAT)是固氮鱼腥藻氨同化的重要途径。在蛋白质合成受到氯霉素拟制时,NH_4~ 对固氮酶的失活是迅速的,同时GS活力有较大下降,表明NH_4~ 的调控酶的失活或降解。在氮固定条件下,固氮酶活力半衰期小于4小时,GS活力半衰期大于10小时,则GS并不是固氮酶的正调节因子。NH_4~ 和谷氨酰胺(gln)对固氮酶的失活作用随它的浓度增加而提高,但GS并没有这种相关性,低浓度NH_4~ (0.1—0.5mmol/L·NH_4Cl)对GS活力没有抑制作用,高浓度gln(1.0—2.0mmol/L)也没有抑制GS活力,说明GS并不直接调控固氮酶。MSX能消除NH_4~ 和gln对固氮酶的抑制作用,并与藻龄有关。     

大豆叶片尿囊素酶的纯化和性质

被纯化的 L—ALNase比活是 819 nkat/mg,酶的纯度提高了738倍,得率为27％。最适pH 7.4,K_m为13.7 mmol/L ALN,对还原剂和巯基试剂敏感,但5 mmol/L的抗坏血酸可提高酶活26％。磷酸盐和KCN有些抑制作用,但Mn~(2+)无活化作用。7.5％ PAGE,ANP定位测定,是 R_f 0.62、0.64、0.68、0.70和 0.725个同功酶的混合物。     

金属离子对天冬氨酸酶基因工程菌催化合成L-天冬氨酸影响的研究

为研究金属离子对天冬氨酸酶基因工程菌催化合成L-天冬氨酸的影响,以富马酸为底物,分别添加K~+、Mg~(2+)、Mn~(2+)、Ca~(2+)四种金属离子,利用天冬氨酸酶基因工程菌催化合成L-天冬氨酸。结果表明,K+浓度0~2.5 mmol/L时,对L-天冬氨酸的合成没有影响,K+浓度超过2.5 mmol/L时会抑制L-天冬氨酸的合成;Mg~(2+)、Mn~(2+)、Ca~(2+)对L-天冬氨酸合成量影响均呈现先促进后抑制,L-天冬氨酸合成量达到高峰时,Mg~(2+)、Mn~(2+)、Ca~(2+)浓度分别是10 mmol/L、8 mmol/L和11 mmol/L;与对照相比Mn~(2+)促进作用最强,L-天冬氨酸合成量增幅为192.0%。本研究结果可为L-天冬氨酸的工业化生产提供参考。     

宏基因组来源耐Mn2+、热稳定细菌漆酶的分子克隆及酶学特性

【背景】漆酶和锰过氧化物酶(Manganese peroxidase,Mnp)是木质素降解的主要酶,二者有协同效应。Mnp活性依赖于Mn~(2+),而Mn~(2+)是大多数漆酶的抑制剂。【目的】获得耐Mn~(2+)的细菌漆酶用于木质素降解。【方法】构建许昌市某污水河污泥宏基因组文库,通过活性筛选获得细菌漆酶基因lac1542。使用大肠杆菌异源表达Lac1542,研究纯化后的重组蛋白酶学性质并进一步检测了含Lac1542复合酶系降解木质素能力。【结果】测序结果显示lac1542编码一个含513个氨基酸的蛋白。以ABTS为底物Lac1542最适反应pH为4.0,在pH 3.0-6.5范围内酶活性稳定。最适反应温度是75°C,在70°C以下酶活性稳定;100 mmol/L的Mn~(2+)仍能提高酶的活性。动力学参数研究发现,该酶的最适底物顺序为:ABTS丁香醛联氮儿茶酚2,6-DMP愈创木酚。Lac1542/Mnp复合酶系对木质素降解率为47.8%,比单独使用Mnp木质素降解率(22.4%)提高25.4%。Lac1542/Mnp/灰盖鬼伞过氧化物酶(Coprinus cinereus Peroxidase,CIP)复合酶系木质素降解高达71.5%,比Mnp/CIP酶系木质素降解率(48.9%)提高22.6%,加入Lac1542后的复合酶系能明显提高木质素的降解率。【结论】Lac1542的可溶性表达、耐受高浓度Mn~(2+)、热稳定性使得Lac1542可以替代一些经典的真菌漆酶应用于制浆、造纸、纤维素乙醇生产、染料脱色等工业。     

GL-7-ACA酰化酶的分离纯化及性质研究

CU334是高表达GL-7-ACA酰化酶工程菌,其菌悬液用超声波处理后,经硫酸铵分级沉淀、DEAE-Sephadex A-50离子交换柱层析、DEAE—纤维素DE-52柱层析、Sephadex G-200凝胶过滤及羟基磷灰石吸附柱层析等步骤,得到了凝胶电泳均一的GL-7-ACA酰化酶蛋白,纯化了22倍,得率4.0％,比活力为13.8U/mg。用浓度梯度PAGE测得GL-7-ACA酰化酶的分子量为134kD,用SDS-PAGE测得两个亚基分子量分别为15.5kD和58.4kD。用PI法测得等电点为3.5。GL-7-ACA酰化酶反应最适pH为7.0。反应最适温度为37℃,GL-7-ACA酰化酶对底物GL-7-ACA的K_m值为0.50mmol/L,V_(max)为13.10U·mg^(-1)。Ca^(2+)、EDTA和巯基乙醇对该酶有激活作用,Cu^(2+)、Fe^(2+)和Mg^(2+)等有一定程度的抑制作用。产物7-ACA、戊二酸均为GL-7-ACA酰化酶的反竞争性抑制剂,其K_1值分别为16.58mmol·L^(-1)和9.88mmol·L^(-1)。     

3-氰基吡啶水合酶的反应条件及影响因子

研究了芳腈水合酶催化水合3-氰基吡啶生成尼克酰胺的反应条件及影响因子.酶反应的最适pH为8.0,最适温度为25℃.酶在pH8.5于25℃保温4小时或在25—30℃于pH8.0保温3小时是稳定的.反应液中加入Fe~(3 )(1.5 mmol/L)可使酶活力增加 50%,而加入NH_4~ (300 mmol/L)则使酶活降低了67%.Ag~ 和 Hg(2 )”强烈地抑制酶反应活性,在浓度均为 5mmol/L时,抑制率分别为99.7%和100%.NaCN(50 mmol/L)和苯甲腈(100 mmol/L)对酶活性的抑制率分别为78%和85%.该酶作用于 3-氰基吡啶的Km为62.5 mmol/L,V_(max)为85.8 μmol·min~(-1)·mg~(-1).     

卷枝毛霉中苹果酸酶同工酶V的酶学性质

【目的】探讨卷枝毛霉中苹果酸酶同工酶V的性质。【方法】克隆卷枝毛霉中编码苹果酸酶同工酶V的mel基因并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,利用His标签纯化获得了高纯度的重组酶BLME1,并进行酶学性质分析。【结果】该重组酶最适pH为8.0,最适温度为33℃,在此条件下酶活达到92.8 U/mg,对底物L-苹果酸和NADP~+的米氏常数K_m值为0.74960±0.06129 mmol/L和0.22070±0.01810 mmol/L,最大反应速度V_(max)分别为72.820±1.077 U/mg和86.110±1.665 U/mg。金属离子Mg~(2+)、Mn~(2+)、Co~(2+)、Ni~(2+)可以激活BLME1的活性,而Ca~(2+)、Cu~(2+)对BLME1活性则有抑制作用,中间代谢产物草酰乙酸和α-酮戊二酸也会抑制BLME1的活性,但琥珀酸却对BLME1有激活作用。【结论】本实验调查了卷枝毛霉苹果酸酶同工酶V的最适反应温度和pH、动力学参数,以及各种金属离子和中间代谢产物对酶活力的影响,这为以后深入研究该苹果酸酶的功能提供了理论依据和参考。     

马铃薯α-淀粉酶在毕赤酵母中的表达、纯化及其酶学性质的研究

采用RT-PCR法扩增马铃薯夏波蒂的α-淀粉酶成熟肽基因,将其亚克隆至毕赤酵母表达载体pPIC9k上,SacII线性化重组表达载体,电击转化毕赤酵母GS115感受态细胞,构建重组酵母GS115/pPIC9k-amy,利用锥虫蓝法筛选获得高活性转化子(GSamyA5),以终浓度为0.5%甲醇诱导该重组菌表达α-淀粉酶,通过Ni~(2+)-NTA agarose亲和层析纯化,并对其酶学性质进行研究。结果表明:该酶的最适反应温度为45℃,40~50℃酶活较稳定,保温50 min,残留相对活力达92.6%;最适反应pH值为6.0,并在pH 6.0~7.0范围内酶活保持稳定。Ca~(2+)、K~+可促进酶反应,以Ca~(2+)影响为最,相对酶活力提高到125%;Cu~(2+),Fe~(2+),Fe~(2+),Zn~(2+)对该酶有显著抑制作用;Mn~(2+),Mg~(2+)对酶有微弱抑制作用,Li~+、Na~+对酶活影响不大。     

尖镰孢青霉素V酰化酶的纯化及性质

通过硫酸铵沉淀、硅藻土吸附、DEAD-纤维素离子交换层析和Sephadex G-200凝胶过滤,由尖镰孢(Fusarium oxysporum)FP941培养滤液中得到了聚丙烯酰胺凝胶电泳均一的青霉素V酰化酶。酶作用最适pH为7.0,最适温度为50℃。酶在pH6.0—8.0和42℃以下稳定。酶作用青霉素V的米氏常数Km为4.65×10~(-3)mol/L;苯氧乙酸是酶的竞争性抑制剂,抑制常数Ki为23.87×10~(-3)mol/L;6-氨基青霉烷酸是酶的非竞争性抑制剂,抑制常数Ki为30.01×10~(-3)mol/L。某些金属离子对酶有抑制作用,Fe~(2+)最强,其次是Hg~(2+)和Cu~(2+)。用SDS凝胶电泳测定酶亚基分子量为77600;用分子筛测定自然酶分子量为148000。     

溶葡球菌酶在乳酸克鲁维酵母中重组表达、诱变、优化及酶学研究

根据模仿葡萄球菌(Staphylococcus simulans)的溶葡球菌酶基因序列以及乳酸克鲁维酵母密码子偏好性设计引物扩增溶葡球菌酶基因表达片段,构建溶葡球菌酶(lysostaphin,Lys)基因表达载体(p KLAC1-Lys),转化乳酸克鲁维酵母(K.lactis GG799),实现了Lys基因的分泌表达。对重组菌株(K.lactis GG799/p KLAC1-Lys)进行NTG随机化学诱变,优化表达条件,筛选获得高表达菌株,并通过Ni-NTA亲和层析纯化蛋白并研究其酶学性质。结果表明:通过诱变重组溶葡球菌酶乳酸克鲁维菌株,Lys酶比活性提高了约5.2倍(约8 000U/L)。最适接种量为40g/L,诱导过程中每24h添加一次终浓度为20g/L的半乳糖和NH_4NO_3可提高酶比活性,最适表达p H为7.0~7.5,最适反应p H为7.0~8.0,最适反应温度为37℃。实验表明,低于40℃,p H 3~6之间时,重组溶葡球菌酶较稳定。Sr~(2+)对其酶活性有明显的促进作用,Ba~(2+)、Ca~(2+)、Zn~(2+)、Cu~(2+)、Mn~(2+)、Mg~(2+)对其有明显的抑制作用。     

头状轮生链霉菌谷氨酰胺合成酶的研究 Ⅰ.酶的生成和纯化

以氨为氮源培养头状轮生链霉菌(Streptoverticillium caespitosus)时粗抽提液中谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase, GS)对热稳定,以硝酸盐为氮源时GS对热不稳定。以硫酸链霉素沉淀、热处理、聚乙烯亚胺(PEI)沉淀和Affini-gel Blue柱纯化了前者,以DE-52柱和Affini-gel Blue柱纯化了后者,纯化后两个酶分子量同为550000,亚基分子量同为56000,热稳定性相同,转谷氨酰基酶活力的最适pH均在6.4～6.7之间,对谷氨酰胺的K_m值同为11.1mmol/L,寸羟胺的K_m值同为1.6mmol/L,所以认为此菌中总是同一GS表现出活力。     

D-泛解酸内酯水解酶的固定化及酶学性质

为有效提高D-泛解酸内酯水解酶的利用效率,笔者选择合适的载体对酶进行固定化,在优化固定化条件的同时研究固定化酶的最佳反应条件和酶学性质。结果表明,选择的最佳固定化载体为树脂D380,最佳固定化条件为:酶的吸附添加量为30 U(以1 g湿树脂计),吸附pH 7.0,吸附温度30℃,吸附时间5 h,戊二醛体积分数0.1%,交联时间1 h。在最优条件下得到的固定化酶的比酶活为(11.5±0.12) U/g。固定化酶的最适反应温度为37℃,最适反应pH为7.5。游离酶和固定化酶的动力学常数K_m分别为170.25和207.60 mmol/L。Ca~(2+)对酶促反应有激活作用,Mn~(2+)对该酶有较强的抑制作用。     

新型扁桃酸消旋酶的基因挖掘和性能表征

消旋酶是实现手性化合物去消旋化制备光学纯化学品的重要工具,来源于恶臭假单胞菌的扁桃酸消旋酶(MR),是目前唯一可以催化两种构型扁桃酸互相转换的消旋酶。通过基因组数据挖掘获得了9个新的扁桃酸消旋酶基因及活性蛋白,其中来源于放射性土壤杆菌Agrobacterium radiobacter的Ar MR酶对扁桃酸和邻氯扁桃酸具有较高的催化活力,而且该酶的异源表达水平也较理想。ArMR催化扁桃酸消旋反应的最适温度为50℃,最适pH为7.8。该酶在30℃、40℃和50℃下的半衰期分别为70.7、7.2、0.17 h。ArMR对(R)-和(S)-扁桃酸的K_M值分别为1.44 mmol/L和0.81 mmol/L,k_(cat)值分别为410 s~(–1)和218 s~(–1);对(R)-和(S)-邻氯扁桃酸的KM值分别为6.48 mmol/L和6.37 mmol/L,而k_(cat)值为0.22 s~(–1)和0.23 s~(–1)。Mg~(2+)和Mn~(2+)对该酶的活力有促进作用,而Zn~(2+)使其完全失活。新型扁桃酸消旋酶的发现和表征为今后此类酶的深入研究和开发提供了更多资源和数据参考。     

Mg~(2 )对巯基修饰类囊体膜H~ -ATP酶的质子传导途径的调节效应

镁离子为巯基修饰类囊体还原型H~ -ATP酶光活化所必需。介质中MgCl_2浓度由2mmol/L增加到10mmol/L时,解联剂NH_4Cl对H~ -ATP酶光活化的抑制作用明显减弱,而对跨膜⊿pH的消除效应并未减轻。介质中Mg~(2 )浓度的增加不影响DCMU对H~ -ATP酶光活化的抑制作用。 介质中含40μmol/LADP时,低浓度NH_4Cl对H~ -ATP酶催化的刺激效应被消除,仅呈现抑制作用。这种NH_4Cl对H~ -ATP酶催化活性的抑制作用随着反应介质中Mg~(2 )浓度的增加而降低,因此认为Mg~(2 )参与质子传导途径的调节。