酵母属间原生质体融合改进菌株木糖发酵性能

通过单倍体分离和紫外诱变,获得了１４株树干毕赤酵母（Ｐｉｃｈｉａｓｔｉｐｉｔｉｓ）７１２４和酿酒酵母（Ｓａｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）１３００的营养缺陷型突变株。用聚乙二醇（ＰＥＧ）和电诱导融合及致死融合等方法,实现了树干毕赤酵母和酿酒酵母的属间原生质体融合。融合子能发酵木糖产生酒精,其厌氧发酵木糖和木糖葡萄糖混合液的能力明显优于亲株,耐酒精的性能也比亲株树干毕赤酵母７１２４有所提高。融合子经ＤＮＡ含量、细胞体积测定和稳定性能实验证明为稳定融合子。     

有淀粉糖化酶活性的耐高温酿酒酵母的构建研究

通过诱导Hu—TY一1(耐高温酿酒酵母)产孢及单孢分离得到的单倍体株Hu—TY—l—A(Sa-ccharamyces cerevisiae)与具有STAl、STA2、STA3(淀粉糖化酶)遗传因子的酵母(S．Dias-taticus)单倍体和纯合二倍体进行相同交配型的种间原生质体融合,融合率为3．3×1O^-6-8．7×1O^-6。融合子的细胞形态、大小、DNA含量、生长和发酵特性等方面均不同于亲株。融合株BA-2、BA-3、CA-18、DA-2、CCA-30、其细胞体积与DNA含量为亲株之和,30℃生长速率与生物量为亲株的2—3倍,40℃生长速率与生物量为亲株HU－TY－1－A的1．3－1．6倍,能够利用淀粉,并且在40℃高温葡萄糖发酵酒精产率比糖化酵母高,比HU－TY－1－A低,是一些有淀粉糖化酶、耐高温的酿酒酵母新菌株。     

三角酵母二倍体菌株的选育

由三角酵母(Trigonopsis variabilis)原生质体融合,获得了35株原养型融合子。通过对其中四株进行详绌分析表明,融合子细胞体积和DNA含量为两亲株之和,苏木精染色显示单核,这些结果证明融合子为亲株的二倍体。此外,融合子的生长速度、D-氨基酸氧化酶以及细胞蛋白质含量均明显高于亲株。电镜形态观察：进一步证明融合子细胞大于亲株。     

酵母菌属间原生质体融合获得能发酵乳糖生产酒精的融合体

本文报道了用聚乙二醇(PEG)诱导酿酒酵母 （Saccharomyces cerecisiae)和乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)属间原生质体融合。融合体的细胞体积约为两亲株之和;融合体的DNA含量约为亲株的两倍;融合体具有双亲株的遗传标记。融合体不仅能发酵葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、半乳糖、棉子糖和蜜二糖,而且也能发酵乳糖。在以乳糖为碳源的培养基中,融合体的发酵力是亲株乳酸克鲁维酵母的两倍多;在以葡萄糖为碳源的培养基中,融合体与亲株酿酒酵母的发酵力接近。     

产金属硫蛋白酵母菌原生质体电融合研究

采用原生质体电融合技术,由不能水解淀粉、细胞生物量低,只抗Cu²⁺、金属硫蛋白(MT)中cys含量高的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae,a)单倍体BD101-25和具淀粉水解能力、细胞生物量高、Cu²⁺、Cd²⁺抗性高、金属硫蛋白中cys含量低的异常毕赤酵母(Pichiaamomala,a)单倍体BD102-13获得4个融合株。融合组合有两亲株属间融合和单一亲株种内融合两类。融合株细胞体积、DNA含量均近似于两亲株细胞之和,并具有水解淀粉能力,Cu²⁺、Cd²⁺抗性高,细胞生物量高,MT中cys含量高等特点。属间融合株Cu²⁺、Cd²⁺抗性的遗传性状稳定。     

猪β干扰素在毕赤酵母中的分泌表达及其对伪狂犬病毒的抑制作用

了研制高活性的重组猪β干扰素,对PoIFNβ成熟蛋白第3、7和164位的3个氨基酸密码子进行毕赤酵母偏嗜性改造并构建了酵母表达载体pPICZαAPIB。pPICZαAPIB经SacⅠ酶切线性化后电转化导入毕赤酵母菌株X33。多株PCR鉴定为阳性的酵母转化子经甲醇诱导发酵分泌表达了PoIFNβ, 其中B1株酵母的PoIFNβ产量最高,约为2.5×10.5U/mL,其表达量约为60μg/mL,比活为4.17×10.6U/mg。将发酵上清液用PEG20000浓缩后进行SDSPAGE和Western blot检测,结果表明表达产物是分子量约为28kDa和25kDa蛋白的混合物,两者均可与PoIFNβ阳性抗血清发生特异反应。表达产物比PoIFNβ理论推导分子量（约20.8kDa）大,推测可能是表达产物发生了不同程度的糖基化。重组PoIFNβ对伪狂犬病毒在细胞中增殖可呈现抑制作用,并且rPoIFNβ对伪狂犬病毒在MDBK细胞上早期增殖的抑制效果最为明显。     

电融合技术选育能利用木糖和纤维二糖生产乙醇的菌株

以携带营养缺陷型标记的季也蒙假丝酵母(Candida guilliermondii s 208 Arg-)和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae 314)为亲本,采用GH-40l型电诱导基因转移／细胞融合仪,用3个强度为18kV／cm,时程为10μs,间隔为1 s的高压电脉冲处理原生质体,营养互补的融合频率为3．6×10^-3。在选择和非选择培养基上连续传代20余次后,对得到的稳定的融合子进行分析比较,结果表明,它们是两亲株融合后形成的融台体。其中有两株融合子能利用木糖和纤维二糖生产乙醇,F－106利用D－木糖(2％)和纤维二糖(2％)生产乙醇的产量分别为3．1g／l和1．05g／l,F－308分别为0．2g／I和2．8g／l。     

啤酒酵母和产朊假丝酵母属间原生质体融合子的筛选

利用不可逆生化抑制剂碘乙酸抑制一亲株细胞的生理活性和利用两亲株细胞间生理性状的差异性,进行啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和产朊假丝酵母(Candida utilis)原生质体融合子的筛选,属间原生质体融合率为3.47×10~(-6)。经菌落形态比较,碳化合物的同化和发酵,DNA含量测定,酯酶型分析,细胞核染色,产孢试验和自然的核分离实验证明,融合子分三种类型:87.21%产朊假丝醇母型;9.02%啤酒酵母型;3.77%真正核融合子型。     

产二羧酸热带假丝酵母乙酰CoA合成酶的研究

测定了利用正烷烃积累相应链长二羧酸的热带假丝酵母(Candida tropicalis)突变株U3-2及其亲株Nn,1230乙酰Coa合成酶的活力。该酶反应的最适pH为6．8;作用于醋酸盐的K。值为l㈨01『L;此酶对热极不稳定,突变栋的酶较亲株尤甚o 300c保温半小时,前者的酶活力丧失l 8％,后者丧失50％;保温两小时后,前者丧失5 5％,而后者丧失95％的活力。亲抹乙酰c。A合成酶活力比突变株的高一倍。也j兜察到突变株的生长比亲林慢得多。因此在用突变株u;一菌发酵正烷烃生产二羧酸时,应适当延长种子的培养时间。     

克鲁维酵母种间原生质体融合的研究

乳酸克鲁维酵母(Kluyueromyces lactis Y12—1)和脆壁克鲁维酵母(K.fragilis8554)是乳糖酶生产菌株。应用原生质体融合技术进行了两菌株种问融合的研究。通过试验．原生质体形成及再生的最佳条件为：对数期的细胞,2％的蜗牛酶．30℃酶解30分钟．原生质体形成率90％以上,再生率20%左右。原生质体融合由聚乙二醇(PEG)诱导。K.lactisY12-l不能旋酵菊糖;K.fragilis 8554不能同化D－松三糖和麦芽糖;利用二菌株自身的营养缺陷性质获得融合子。融合子既能发酵菊糖又能同化D－松三糖和麦芽糖;融合子的DNA含量约为二亲株之和;融合子的菌落形态与亲株相比有一定差别．在以乳糖为碳源的培养基中,融合子的乳糖酶产量提高14一l6％;连续15次传代,融合子稳定。     

SKW6细胞在转导6A8 α-甘露糖苷酶反义cDNA后对抗Fas抗体诱导的凋亡

鉴于蛋白质糖基化的重要生物学意义,以腺相关病毒为载体,把编码6A8 α-甘露糖苷酶的cDNA 3′端1358 bp的反向片段转导入EB病毒转化的B细胞株SKW6,探讨6A8 α-甘露糖苷酶表达抑制对抗Fas抗体诱导凋亡的影响.反义6A8转导成功及表达用Northern杂交及RT-PCR检测,6A8 α-甘露糖苷酶表达用Con A结合试验检测.Giemsa染色,AnnexinⅤ染色及梯形DNA电泳显示,Fas抗体能诱导SKW6细胞凋亡,但6A8 α-甘露糖苷酶表达抑制的细胞对Fas抗体诱导的凋亡发生抵抗,而转导正义6A8或空载载体则无影响.6A8 α-甘露糖苷酶表达状况对SKW6细胞表面Fas分子表达没有影响.     

酿酒酵母与糖化酵母的种间原生质体融合及其融合子的鉴定

本文报道了酒精生产菌株K氏酿酒酵母Sacchormyces cerevisiae var.ellipsoideus的HUK-1(his-,二倍体,但在我们所试的5种产孢培养基上均不产孢)与糖化酵母Sac—charomyces diastaticus 7c(arg-,a)的种间原生质体融合,其营养标记互补的融合频率约是2．07×10^-6—3．40×10^-5。这些融合子曾在选择培养基MMs或Mmo上连续传代10次,以促进两亲核的融合。融合子的酒精发酵特性,细胞形态、体积大小、DNA含量、繁殖速率、发酵强度以及产孢能力等方面的观察和测定结果表明,均不同于双亲菌株。用显微操作器解剖了个别原养型融台子HU—KDF—185的4孢子子囊,在获得的93个单孢株中,其淀粉发酵特性和遗传标记均有双亲类型的分离或重组现象。上述实验结果充分证明了不同倍性的酵母之间可以通过原生质体融合获得种间杂种。     

耐热酵母与酿酒酵母原生质体融合的研究

酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)396是利用甘蔗糖蜜生产酒精的生产菌株,假丝酵母(Candida sp·)C₆是我们从云南温泉底泥中筛选到的一株能在45℃生长良好的耐热酵母,我们应用原生质体融合技术进行了两菌株属间融合的研究。通过亚硝基胍(NTG)诱变得到的营养缺陷型菌株396(arg^－)和C6(lys^-),其融合频率为O．91×10^-5。从检出的融合子中挑选6株进行考核、其细胞体积平均为亲株的1．3倍,DNA含量平均为亲株的1．6倍,培养特征、形态、大小和生理生化特征表现不一,特别是糖类的同化试验。除F₂、F₁₄外,其他4株可以排除异核体形成的可能性。比较了在28℃,40℃和45℃培养条件下出发亲株396、C₆、直接亲株396(arg^-)C₆(lys^-)和融合子F₁、F₇、F₁₂,F₁₃的生长曲线、基质利用率和乙醇产率等,得到一株在40℃培养条件下糖的利用率为94．3％、乙醇产量为59．7g／L的属间融合株F₁₃。     

利用细胞质导人法选育嗜杀啤酒酵母

利用细胞质导入(Cytoduction)法中的核融合缺陷细胞融合技术,在对酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)D518菌株不做任何遗传标记,将嗜杀酵母5045菌株的嗜杀质粒转移到受体菌D518中,获得了具有两亲株优良性状的融合子KDl02菌株。对融合于分析表明：融合子遗传性状稳定,不仅含有供体菌5045的嗜杀质粒,而且受体菌D518的核基因被原封不动地保留下来,为异质体细胞(Heteroplasmon)。将融合子KDl02菌株用于小型、中型及生产性酿酒试验。结果表明．具有与亲株D518同样的酿造特性。在发酵过程中．能抑制野生酵母污染,净化发酵体系。对于保证啤酒纯种酿造及提高成品酒的生物稳定性具有明显效果。     

啤酒酵母对杀假丝菌素抗性的遗传分析

杀假丝菌素(Candicidin)在0．8μ／ml的YEPG平板上能完全抑制呻酒酵母(Saechar-mycescerevisiae) H802-1B (a,lys2)及H802-5D(a,ade,ural)的生长。将H802-1B涂布在含有5—70μg／ml的抗生素平板上分离得到抗性突变体。第一次突变体的最高抗性水平是50μg／ml,从5—50μg／ml 抗生素平板上共获得39株自发突变株,第二次抗性突变株是将第一次突变体涂布在更高浓度(70—90μg／ml)的抗生素平板上分离到的。部分抗性突变株(70μg／ml和90μg／ml)与亲株H802-5D交配,测其分离子的抗性,所有杂合二倍体表现：抗性：敏感性为2：2分离现象。H1121-1A(a,lys2,CADR9)XH113-8A(a, ural,CADR30)的杂种抗性分离行为：PD(17个子囊),NPD(2个子囊)T(4个子囊)口遗传分析证明,实验用的抗性突变体有两个显性抗性基因CADHr30和CADR90．     

凝集性酵母融合株MWF29的啤酒酿造试验研究

利用线粒体DNA突变标记和电诱导融合技术获得的酵母融合株MWF29,经过连续七代60—120吨级生产规模的发酵试验表明,该菌生产性能良好,具备了两个亲株的优良性状,发酵力强,酿酒风味好,发酵流程中及最终产品的化验指标全部达到了优质酒的要求。发酵后期细胞的凝集性好,90%以上的菌体自行凝集下沉到罐底,不需经过离心便可顺利过滤,并且减少用于过滤的硅藻土用量。生产实践证明酵母融合株MWF29是一株性能稳定的优良生产菌株。本工作证明应用线粒体DNA突变抗性菌进行原生质体融合是工业酵母育种的一种简便有效的手段,特别     

巴西固氮螺菌Yu62 draTG基因及其下游区域的定位诱变分析*

用卡那霉素盒(Kmr-cassette)插入法,对巴西固氮螺菌(Azospirillum brasilense)Yu62的draTG基因及其下游区域进行了诱变,并获得相应的突变株。研究表明：draT变突株的固氨酶活性不再受铵抑制,而draG突变株在有铵时则丧失固氮酶活性,但当铵耗尽后却不能像野生型菌株那样恢复活性。draTG下游区域突变株YZ4(突变位点距draG约2kb)在无氮及限铵条件下,其固氮酶活性比野生型菌株的高,但其nifH-lacZ转录融合子的表达并不受影响,说明该区域可能有参与固氮酶活性水平调控的基因。     

木聚糖酶XYNB分子中折叠股B1和B2间的疏水作用对酶热稳定性的影响

对来源于Streptomycesolivaceoviridis的高比活木聚糖酶XYNB进行同源建模,并结合嗜热木聚糖酶氮末端芳香族氨基酸疏水作用的结构分析,设计了XYNB的T11Y定点突变,观察XYNB分子中折叠股B1和B2的疏水作用对酶的热稳定性的影响。将突变酶XYNB′在毕赤酵母中表达,表达的XYNB′经纯化后与原酶XYNB(同样经毕赤酵母表达后纯化)进行酶学性质比较,结果表明,XYNB′的耐热性比XYNB有明显的提高,但最适温度与原酶一样为60℃。另外,XYNB′的最适pH、Km值及比活性均有一定的改变。实验证实了木聚糖酶XYNB的氮端芳香族氨基酸之间的疏水相互作用与其热稳定性相关,为进一步的结构与功能研究提供了优良的基因材料。     

苏芸金杆菌的质粒检测及载晶体蛋白合成基因的质粒在不同菌株间的传递

分析了苏芸金杆菌(Bacillus thuringiensis)7个变种19个野生菌株及无晶体(sp+cr-)和无芽孢(sp-cr+)突变株的质粒图型,证实了苏芸金杆菌的质粒组成既有变种的特异性,亦有菌株的特异性。载有晶体蛋白质合成基因的质粒,B. thuringiensis var．Kurstaki HD-191 菌株可能为42和50Mdal,B．Thuringiensis var. aizawai HD-282菌株为47Mdal, B．Thuringiensis var．Israelensis IPS-82菌株为57Mdal的质粒,而B．Thuringiensis var. wuhanensis 140 菌株的此种基因则可能不在质粒上而在染色体中。HD-191载晶体蛋白合成基因的质粒以很高频率被传递给其无晶体突变株HD-1并在后者细胞中表达。B. thuringiensis var. israelensisIPS-82菌株和 B．Thuringiensis var. kurstaki 无晶体突变株HD—1之间载晶体蛋白合成基因质粒的传递未能成功,提示可能存在着不相容性的障碍。     

假单胞菌M18菌株的PltR因子特异性正调控藤黄绿菌素合成

经生物信息学分析, 在假单胞菌M18(Pseudomonas sp. M18)菌株的藤黄绿菌素(pyoluteorin, Plt)生物合成基因簇上游定位了一个属于LysR家族的调控因子编码基因pltR. 运用同源重组技术, 构建了pltR失活的突变菌株M18TRG, 在King’s B培养基中, 与野生型菌株相比, Plt合成能力下降了70%, 而吩嗪-1-羧酸(phenazine-1-carboxylic acid, PCA)的合成能力不受影响. 反式互补pltR的突变株能回复Plt的合成能力达到野生型水平. 在菌株M18中过表达pltR, Plt产量提高13倍, PCA产量没有改变. 这些结果表明pltR基因表达产物是Plt生物合成的特异性正调控因子. 在野生型菌株M18和不产Plt的突变株M18T中, pltR基因表达量无显著差异, 表明pltR基因的表达不受Plt调控. 与野生株相比, 突变株M18TRG中的转录融合plt-lacZ表达量显著降低, 表明PltR对Plt的正调控作用主要发生在转录水平上. 对pltR基因在gacA突变株M18G和rsmA突变株M18R中的表达量的进一步研究发现, PltR参与了gacA基因对Plt的合成的正调控, 但不参与rsmA基因对Plt合成的负调控.