假单胞菌M18菌株的PltR因子特异性正调控藤黄绿菌素合成

经生物信息学分析, 在假单胞菌M18(Pseudomonas sp. M18)菌株的藤黄绿菌素(pyoluteorin, Plt)生物合成基因簇上游定位了一个属于LysR家族的调控因子编码基因pltR. 运用同源重组技术, 构建了pltR失活的突变菌株M18TRG, 在King’s B培养基中, 与野生型菌株相比, Plt合成能力下降了70%, 而吩嗪-1-羧酸(phenazine-1-carboxylic acid, PCA)的合成能力不受影响. 反式互补pltR的突变株能回复Plt的合成能力达到野生型水平. 在菌株M18中过表达pltR, Plt产量提高13倍, PCA产量没有改变. 这些结果表明pltR基因表达产物是Plt生物合成的特异性正调控因子. 在野生型菌株M18和不产Plt的突变株M18T中, pltR基因表达量无显著差异, 表明pltR基因的表达不受Plt调控. 与野生株相比, 突变株M18TRG中的转录融合plt-lacZ表达量显著降低, 表明PltR对Plt的正调控作用主要发生在转录水平上. 对pltR基因在gacA突变株M18G和rsmA突变株M18R中的表达量的进一步研究发现, PltR参与了gacA基因对Plt的合成的正调控, 但不参与rsmA基因对Plt合成的负调控.     

假单胞菌株M18gacA基因对BHL和HHL合成正调控及对PCA合成负调控无相关性

经初步鉴定,假单胞菌株(Pseudomonassp.)M18至少能产生5种N-酰基高丝氨酸内酯类(N-acyl-homoserinelactones,AHLs)信号分子,它们是:N-丁酰高丝氨酸内酯(N-butyryl-L-homoserine lactone,C4-HSL,BHL)、N-己酰高丝氨酸内酯(N-hexanoyl-L-homoserine lactone,C6-HSL,HHL)、N-3-氧-己酰高丝氨酸内酯[N-(3-oxohexanoyl)-L-homoserinelactone,3-Oxo-C6-HSL,OHHL]、N-3-氧-辛酰高丝氨酸内酯[N-(3-oxooctanoyl)-L-homoserine lactone,3-Oxo-C8-HSL,OOHL]和N-3-氧-癸酰高丝氨酸内酯[N-(3-oxodecanoyl)-L-homoserine lactone,3-Oxo-C10-HSL,ODHL)。在gacA突变菌株M18G中,信号分子的积累量明显减少,且只能检测出其中的4种;同时,吩嗪-1-羧酸(Phenazine-1-carboxylic acid,PCA)的合成量比野生株M18提高了2倍左右。在M18菌株中,基因rhlⅠ的编码产物参与BHL和HHL的合成。构建rhlI’-’lacZ翻译融合表达质粒pMEIZ,分别导入野生株M18和突变株M18G,突变株M18G的半乳糖苷酶活性比野生株M18下降约40%,表明GacA对基因rhlI的表达具有正调控作用。但是,在野生株M18和突变株M18G的发酵液中,分别或同时添加过量的外源BHL和HHL,对PCA合成的影响不显著,表明在突变株M18G中,PCA合成量的增加与BHL和HHL合成量的减少没有明显的相关性。     

假单胞菌M-18qscR突变株的构建及其对抗生素合成的调控

在革兰氏阴性菌中,全局性调控因子QscR参与菌群传感调节系统,调节多种毒素因子、次生代谢产物、稳定期基因以及参与生物膜形成的基因的表达,它通过与靶基因DNA启动子的调节元件结合,调节基因转录。假单胞菌株(Pseudomonas sp.)M-18是促进植物生长的根际细菌,能同时分泌藤黄绿菌素(pyoluterion,Plt)和吩嗪-1-羧酸(phenazine-1-carboxylicacid,PCA)。运用同源重组技术,构建了假单胞菌(Pseudomonas sp.)M-18株的qscR突变菌株M-18Q。比较野生株M-18和突变株M-18Q生物合成PCA和Plt的产量,在28℃恒温条件下,在PPM和KMB培养基中M-18Q菌株合成PCA的量分别约为野生型M-18菌株的4～6倍和3～5倍,分别达到480μg/mL和140μg/mL。在PPM培养基中,野生株M-18和突变株M-18Q几乎都没有Plt的合成,而在KMB培养基中,突变菌株和野生型M-18合成Plt的量基本一致。反式互补实验表明,在qscR突变株M-18Q中,PCA生物合成受到抑制而Plt的生物合成却不受影响。phzA基因是吩嗪合成基因簇中第一个基因,phzA‘-’lacZ翻译融合实验表明,qscR基因产物通过抑制PCA合成基因簇的表达,实施负调控作用。结果表明qscR基因是作为一个全局调控基因区别性地调控PCA和Plt的生物合成。