破骨细胞形成抑制因子研究进展

破骨细胞形成抑制因子（OPG/OCIF）是最近发现的一种参与调节骨密度的糖蛋白,是一个肿瘤坏死因子(TNF)受体超家族的新成员,其氨基酸序列中具有TNF受体结构类似区.成熟的OPG/OCIF具有7个结构域,可分为三个功能区,即：TNF受体结构区、致死结构区和肝素结合区.OPG/OCIF基因定位在8q23～24上,由5个外显子和4个内含子组成,其表达受到与骨的形成和破坏有关因子的调控：如TGF-β1、1,25(OH)₂VD₃、TNF-α等等.OPG/OCIF抑制骨的破坏和吸收机制主要是抑制破骨细胞的存活,引起破骨细胞凋亡和抑制破骨细胞形成.     

信号肽捕获系统的建立

细胞分泌蛋白的分泌有赖于蛋白质N端的信号肽的存在,利用酵母建立了从cDNA文库中筛选编码信号肽的基因片段的遗传系统,为此,用一步基因破坏法对酿酒酵母EGY48基因组中的suc2基因（编码酵母蔗糖转换酶）进行了定位突变,获得了无蔗糖转换酶表达的酵母株EGY48－suc。将无信号肽的suc 2成熟肽基因克隆于酵母乙 氢酶（ADHI）基因启动子下游,得到用于文库筛选的酵母真核表达工体,启动子与成熟肽基因之间为多克隆位 ,用于插入待筛选的CDNA文库,用此载体转化酵母EGY48－suc,所得克隆可以在葡萄糖为碳源的培养基上生长,但不能在以棉子糖为碳源的培养基上生长,在suc 2成熟肽基因前分别插入suc 2信号肽基因片段或人IL－2受体α链信号肽基因片段,然后转染EGY48－suc,所得克隆既能在以葡萄糖为碳源的培养基上生长,也能在以棉子糖为碳源的培养基上生长,表明构建的系统可用于筛选插篱多克隆位点cDNA片段是否具有编码信号肽的功能。     

OPGL对骨骼和淋巴发育的作用

OPGL是OPG（osteoprotegrin）的配体。人opgl cDNA编码317个氨基酸的多肽,是一种跨膜蛋白。研究表明OPGL是一种新发现的破骨细胞分化因子。破骨细胞前体在OPGL的作用下,可分化为成熟的破骨细胞。OPGL可激活离体的成熟破内细胞吸收骨质,最新的研究表明,opgl-knockout小鼠出现严重的石骨症,对骨骼再造形具有重要的作用;并且小鼠的胸腺细胞和B淋巴细胞的发育受阻,淋巴结的器官发生也受到抑制,不能形成淋巴结。     

人骨保护素N端片段在大肠杆菌中的表达及其活性分析

骨保护素 (OPG)成熟肽N端D1～D4结构域仅由 2个外显子编码 .以人基因组DNA作为模板 ,采用重叠延伸PCR得到N端D1～D4域编码序列 ,并在其上游引入 2×His密码子序列 ,然后克隆入载体pQE 30进行表达 ,SDS PAGE表明 8×His融合蛋白主要以包涵体形式存在 ,可被抗OPG抗体识别 .变性条件下通过Ni NTA金属螯合亲和层析对表达产物进行纯化后再经梯度透析进行复性 ,采用破骨细胞样细胞 (osteoclast likecell ,OLC)诱导分化实验来检测重组蛋白的生物活性 ,证实单核 巨噬细胞集落刺激因子 (M CSF)和破骨细胞分化因子 (ODF)可协同促进多核OLC的生成 ,但加入重组OPG片段后 ,OLC生成显著减少 .     

趋化因子配体18重组成熟肽段的表达

目的构建PET SUMO-CCL18原核表达质粒,并表达、纯化获得重组趋化因子配体18成熟肽段。方法从人卵巢癌组织中克隆CCL18基因全长,继而扩增表达成熟蛋白质的核酸序列,连接人PETSUMO载体,重组阳性克隆转入感受态细胞BL21（DE3）中IPTG诱导表达,基质辅助激光解吸／电离质谱技术（MALDI-TOF）验证后以SUMO蛋白酶切除载体部分,纯化浓缩,MALDI-TOF鉴定表达结果。结果测序分析证实,克隆人PETSUMO载体的CCL18序列与Genbank中报道序列完全一致,纯化后蛋白质谱鉴定与天然CCL18成熟蛋白序列一致。结论成功构建了高表达CCL18蛋白的表达系统,得到重组CCL18成熟肽段,为进一步研究CCL18蛋白在卵巢癌中的作用提供实验基础。     

联合补充维生素D、胶原肽和钙对成骨细胞发育的影响研究

目的：观察联合补充维生素D、胶原肽和钙对MC3T3-E1成骨细胞增殖及对骨保护素细胞内核因子κB受体活化因子配体（receptor activator of NF-κB ligand,RANKL）、骨保护素（Osteoprotegerin,OPG）基因表达的影响。方法：α-MEM培养基培养MC3T3-E1细胞。检测Ca2+（20 μg/mL）、维生素D（0、10-12、10-11mol/L）、胶原肽（0、50、100μg/mL）三者交互作用剂量对MC3T3-E1细胞增殖的作用及RANKL、OPG mRNA表达。结果：维生素D、胶原肽和钙交互剂量作用下细胞增殖水平无明显差异。维生素D联合钙能够明显降低RANKL mRNA表达水平,提高OPG mRNA表达水平,降低RANKL/OPG比值。而胶原肽联合钙对RANKL以及 OPG mRNA表达无明显影响。结论：维生素D联合钙可通过抑制小鼠成骨细胞RANKL mRNA表达、促进OPG mRNA表达,从而促进骨的形成,抑制骨的吸收。维生素D和钙联合补充胶原肽,对成骨细胞RANKL,OPG mRNA表达并无明显影响。     

人骨形成蛋白-7成熟肽基因在巴斯德毕氏酵母中的分泌表达

目的:利用甲醇酵母表达系统,构建重组人骨形成蛋白-7(rhBMP-7)成熟肽的基因工程菌,并实现其分泌表达。方法:采用PCR方法,依据GenBank数据库中hBMP-7成熟肽序列(AccessionNo.NM_001719)设计并合成一对引物,从已构建的含hBMP-7的克隆载体中扩增获得人骨形成蛋白-7成熟肽基因片段,并以pPIC9K为表达载体构建重组表达质粒,电转化巴斯德毕氏酵母SMD1168,于30℃进行甲醇诱导分泌表达,经筛选获得rhBMP-7成熟肽表达株,并进行了表达产物的活性测定。结果:表达产物存在于培养上清中,约占分泌蛋白总量的8%。经Western印迹分析可以检测到重组表达产物,ELISA检测其具有特异性结合活性。结论:构建了重组人骨形成蛋白-7成熟肽的基因工程菌并在甲醇酵母中实现了分泌表达,为进一步的活性及功能研究奠定了基础。     

重组人骨形态发生蛋白－2成熟肽在大肠杆菌中的表达及其诱导成骨活性

报告了人骨形态发生蛋白－２（ＢＭＰ－２）成熟肽的基因克隆,及其在大肠杆菌中的表达。用ＡｆｌⅡ酶剪除ＢＭＰ－２ｃＤＮＡ中的信号肽及前肽部分的序列,将编码成熟肽的ｃＤＮＡ３′端０．３６ｋｂ基因片段克隆于大肠杆菌表达载体ｐＭＸ－１质粒的ＡＴＧ下游,受控于ＰＬＰＲ启动子。重组子以大肠杆菌ＤＨ５α为宿主细胞进行温度诱导表达。工程菌经４２℃６ｈ诱导后,在ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上出现一条新蛋白带,分子量约为１２ｋＤ,约占菌体总蛋白的２０％。主要以包涵体形式存在的表达产物经初步纯化后,可获得纯度较高的重组人骨形态发生蛋白－２成熟肽（ｒｈＢＭＰ－２ｍ）。小鼠肌肉植入试验发现。ｒｈＢＭＰ－２ｍ植入后的不同时间,在局部出现间质细胞的聚集和增生、软骨细胞及软骨基质的生成和硬质骨的形成,证明ｒｈＢＭＰ－２ｍ具有明显的诱导新骨形成的作用。     

破骨细胞形成抑制因子TNFR结构区在大肠杆菌中表达、抗体制备及活性测定

破骨细胞形成抑制因子(OPG)对骨的重建与再吸收有重要调节作用,其TNFR结构区行使抑制破骨细胞形成与活性的功能。通过PCR将该区基因片段克隆出来,插入表达载体PET-28a质粒多克隆位点,重组质粒转入大肠杆菌BL21中进行表达,表达产物以包涵体形式存在,包涵体经变性复性后,亲合层析获得重组蛋白。纯化的产物作为抗原免疫兔,得到较高特异性的兔源多克隆抗体。利用小鼠降血钙实验检测变性复性后产物的活性,结果表明该重组蛋白有一定的生物活性。     

人成骨蛋白-1成熟肽基因在大肠杆菌中的克隆与表达

本实验报告了人成骨蛋白 - 1成熟肽基因在大肠杆菌中的克隆与高效表达。通过计算机软件分析 ,采用大肠杆菌偏爱密码子设计并分段合成了人成骨蛋白 - 1成熟肽编码基因片段。用 PCR技术扩增目的基因片段 ,先克隆到 p UC1 9载体上 ,测序正确后再将其克隆到 p BV2 2 0表达载体上 ,以DH5α为宿主菌 ,42℃ ,6 h诱导表达。经 SDS- PAGE鉴定分析 ,在约 1 6× 1 0 3处有一新的蛋白质条带 ,扫描分析表明 ,该条带占菌体总蛋白含量的 40 %左右。     

凋亡抑制因子Survivin在大肠杆菌TB1中的表达纯化及鉴定

 本文旨在克隆凋亡抑制因子Survivin基因,并在大肠杆菌中进行可溶性表达与初步纯化. 采用RT-PCR法,扩增人凋亡抑制因子survivin cDNA,并克隆入原核表达载体pMAL p2X中,转化TB1大肠杆菌感受态细胞.经0.3 mmol/L IPTG诱导2 h后,收集菌体蛋白,进行SDS-PAGE、ELISA及Western 印迹鉴定. 实验获得凋亡抑制因子survivin编码区cDNA,以构建的原核表达载体pMAL-p2X survivin转化菌株后,可表达凋亡抑制因子survivin和麦芽糖结合蛋白(MBP)的融合蛋白,相对分子质量(Mr) 为58 000.并成功利用Factor Xa将融合蛋白裂解开.ELISA和Western 印迹表明,融合蛋白能与抗凋亡抑制因子survivin单克隆抗体特异性结合.获得的凋亡抑制因子survivin全长cDNA可在大肠杆菌TB1中以MBP survivin融合蛋白的形式表达,成功地将survivin目的蛋白和MBP蛋白分离,为深入研究survivin的结构和功能奠定了基础.     

东亚钳蝎K+通道阻断肽cDNA的克隆与表达

目的：克隆东亚钳蝎毒素基因,以进一步研究其生物学和药理学功能。方法：利用已知蝎神经毒素基因序列,设计引物,用RT-PCR方法克隆从蝎毒腺组织蝎毒素cDNA。结果：成功地克隆了一个新的东亚钳蝎毒素基因,该基因开放阅读框架编码59个氨基酸残基,其中前22个为信号肽,成熟肽为37个氨基酸残基,经PCR扩增除去信号肽序列,克隆到pTreHisA质粒中,在E．coli中表达了分子质量为7ku左右融合蛋白,表达产物占菌体总蛋白的21％左右。结论：其结构中含有三对二硫链,6个Cys残基组成蝎K^ 通道毒素共同特征序列-CXXXC-、-GXC-、-CXC-,推断其为K^ 通道阻断肽,命名为KChTX1。已被Gene-bank收录,收录号为AY129234。     

弗氏链霉菌丝氨酸蛋白酶基因的克隆及表达

从一株具有极强的降解羽毛能力的弗氏链霉菌菌株（Streptomyces fradiae var.k11）中纯化得到了一种丝氨酸蛋白酶SFP2。经蛋白测序,得到部分氨基酸序列,设计简并引物,PCR扩增得到部分基因序列,通过构建基因文库,获得了包括信号肽序列在内的完整的基因sfp2(EMBL收录号AJ784940),开放阅读框全长924bp,包括114bp的信号肽编码序列和810bp的酶原编码序列, 其中成熟蛋白编码基因长576bp,编码191个氨基酸,理论分子量为19.112kD。酶原编码基因和成熟蛋白编码基因均在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中得到了表达,酶原编码基因表达产物具有正常的生物学活性,证明了克隆基因的生物学功能。     

人粒细胞集落刺激因子cDNA的克隆、序列鉴定及初步表达

利用多聚酶链反应技术,从人膀胱癌细胞系5637细胞中快速扩增并克隆了人粒细胞集落刺激因子cDNA,序列分析证明,该cDNA包含人粒细胞集落刺激因子的全部编码基因,全长612bp,编码30个氨基酸的信号肽和174个氨基酸的成熟蛋白。其中第43位codon出现一个碱基的突变(CAC→TAC)导至第43位氨基酸的改变(组氨酸→酪氨酸)。经逆转录病毒导入SP2/0细胞并初步表达。结果表明:该基因产物具有G-CSF活性。     

Cloning and heterologous expression of the antibiotic peptide (ABP) genes from Rhizopus oligosporus NBRC 8631

We carried out protein sequencing of purified Antibiotic Peptide (ABP), and cloned two genes encoding this peptide as abp1 and abp2, from Rhizopus oligosporus NBRC 8631. Both genes contain an almost identical 231-bp segment, with only 3 nucleotide substitutions, encoding a 77 amino acid peptide. The abp gene product comprises a 28 amino acid signal sequence and a 49 amino acid mature peptide. Northern blot analysis showed that at least one of the abp genes is transcribed in R. oligosporus NBRC 8631. A truncated form of abp1 encoding only the mature peptide was fused with the alpha-factor signal peptide and engineered for expression in Pichia pastoris SMD1168H. Culture broth of the recombinant Pichia displayed ABP activity against Bacillus subtilis NBRC 3335 after induction of heterologous gene expression. This result indicates that mature ABP formed the active structure without the aid of other factors from R. oligosporus, and was secreted.     

融合基因Mdc-hly的构建及原核表达

构建家蝇天蚕素-人溶菌酶(Mdc-hly)融合基因,实现Mdc-hly基因在大肠杆菌中的表达。通过RT-PCR分别扩增出家蝇天蚕素和人溶菌酶的成熟肽基因序列,再利用Gene-SOEing技术构建融合基因,将融合基因克隆至pET32a表达载体,转化E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导得到高效表达,融合蛋白分子量约为38kD。Western blotting杂交证实了表达蛋白的抗原活性。成功构建了融合其因并进行了原核表达,为进一步的生物活性研究打下基础。     

A novel antimicrobial peptide from skin secretions of the earthworm, Pheretima guillelmi (Michaelsen)

A novel lumbricin-like antimicrobial peptide named lumbricin-PG was isolated from skin secretions of the earthworm, Pheretima guillelmi (Michaelsen), using a procedure of one step Sephadex G-50 gel filtration and one step C₈ reverse-phase high-performance liquid chromatography (RP-HPLC). Its amino acid sequence was determined as FSRYARMRDSRPWSDRKNNYSGPQFTYPPEKAPPEKLIKWNN EGSPIFEMPAEGGHIEP by Edman degradation combined with cDNA cloning and mass spectrometry analysis. The cDNA encoding lumbricin-PG was cloned by cDNA library screening. The predicted protein from the cDNA sequence was composed of 73 amino acid residues including a mature lumbricin-PG and predicted signal peptide. It showed similarity with lumbricin antimicrobial peptide from the earthworm, Lumbricus rubellus by BLAST search. Purified lumbricin-PG exerted potential antimicrobial activities against bacteria and fungi; it showed weak hemolysis activity against human and rabbit red cells.     

人骨保护素在毕赤酵母中的分泌表达及表达产物的生物活性分析(英文)

为了在毕赤酵母表达系统中分泌表达人骨保护素 (osteoprotegerin ,OPG) ,以人骨肉瘤细胞系MG6 3的mRNA为模板 ,采用RT PCR法得到人OPG编码区cDNA ,克隆入毕赤酵母表达载体pPICZ B ,电转化毕赤酵母GS115 (Mut+) ,经 3%甲醇诱导分泌表达人OPG与组氨酸的融合蛋白 .SDS PAGE及Western印迹分析表明 ,有分子量约 6 6kD的目的蛋白表达 .纯化后的表达产物加入体外培养的小鼠骨髓细胞培养基中 ,当浓度为 10 0ng ml时 ,象牙片上骨吸收陷窝的数量及玻片上的TRAP阳性多核细胞的数量均减少 (P <0 0 5 ) .而同时加入人OPG的多克隆抗体后 ,这一抑制作用可被拮抗 ,在浓度为 5 0ng ml时则无此作用 .人OPG蛋白在酵母系统的成功表达 ,为该蛋白的进一步应用研究提供了依据 .     

中华眼镜蛇短链神经毒素cDNA的克隆及在大肠杆菌中的表达

利用RT－PCR技术从中华眼镜蛇毒腺组织中成功地克隆了短链神经毒素CDNA。测序结果表明,该基因开放阅读框架编码83个氨基酸残基,其中对个为信号肽,成熟肽为62个氨基酸残基。该基因与GenBank报道的相同物种的神经毒素基因有相当的同源性,不同物种之间的信号肽序列十分保守。将短链神经毒素CDNA再经PCR扩增除去信号肽序列,克隆到pT7ZZ表达质粒中,转化E.coliBL21（DE3）后,经IPTG诱导可高效表达分子量为23kDa②左右的融合蛋白。表达产物占菌体总蛋白的25％左右。     

猪大肠杆菌耐热肠毒素和热敏肠毒素基因的融合及表达

用聚合酶链反应扩增出猪源大肠杆菌编码ST前体（proST）和LT的B亚单位(LTB)成熟多肽的序列,再通过套式PCR将proST编码序列3′端和LTB编码序列5′端融合,并置于同一阅读框内,得到ST和LTB的融合基因,将此序列克隆到pGEMT质粒中,序列分析后,亚克隆到表达载体pQE30中,在大肠杆菌细胞中得到表达,表达的融合蛋白同时具有ST和LTB的抗原性,且无ST和LT的生物毒性。