多孔聚氨酯固定化黑曲霉产β-葡萄糖苷酶条件的研究

以多孔聚氨酯材料为固定化载体 ,就固定化培养条件中的孢子浓度、pH值、温度、固液比等进行考察 ,经正交试验优化后的最佳固定化条件为固液比为 1 / 90、孢子浓度为 1 0 5mL-1 、温度为 2 8℃ ,pH值 4 .5 ,固定化条件中影响黑曲霉产 β 葡萄糖苷酶的因素显著性顺序为固液比 >孢子浓度 >pH值 >温度。与游离态菌丝体相比较 ,固定化细胞发酵产酶的持续稳定性和活力都有所提高 ,固定化细胞酶产量达 1 30 .0 0u/mL。     

聚乙二醇二缩水甘油醚交联氨基载体LX-1000EA固定化脂肪酶 *

聚乙二醇二缩水甘油醚(PEGDGE)作为双功能环氧试剂,在实验中被用于交联氨基载体LX-1000EA共价固定化海洋脂肪酶,经过处理后的载体共价固定化脂肪酶具有良好的效果。实验经过单因素初筛和正交试验,得到最佳的交联及固定化条件为0.75%交联剂浓度、交联温度35℃、交联时间3h、载体量1.25g、pH9.0、固定化温度55℃、固定化时间1h。对LX-1000EA-PEGDGE固定化酶与游离酶、戊二醛(GA)交联LX-1000HA-GA的固定化酶进行酶学性质的比较,发现LX-1000EA- PEGDGE固定化酶较游离酶最适反应温度未改变,与LX-1000HA-GA相同的是最适反应pH都由7.0提高为8.0。在最适条件中所测LX-1000EA-PEGDGE酶活达到78.84U/g,固定化改变了游离酶的酸碱耐受性,热稳定性和操作稳定性较游离酶和LX-1000HA-GA固定化酶均有提高。LX-1000EA-PEGDGE的热稳定表现优异,在60℃孵育3h后保留90%酶活;使用5次后仍能残余50%酶活;保存30天酶活仍保留60%。首次使用新型双环氧交联剂PEGDGE交联有机氨基载体共价结合固定化脂肪酶,为更有效的固定化方法提供了技术支持,同时也发现交联剂对固定化酶的性质存在较大影响。     

聚乙二醇二缩水甘油醚交联氨基载体LX-1000EA固定化脂肪酶

聚乙二醇二缩水甘油醚(PEGDGE)作为双功能环氧试剂,在实验中被用于交联氨基载体LX-1000EA共价固定化海洋脂肪酶,经过处理后的载体共价固定化脂肪酶具有良好的效果。实验经过单因素初筛和正交试验,得到最佳的交联及固定化条件为0. 75%交联剂浓度、交联温度35℃、交联时间3h、载体量1. 25g、pH9. 0、固定化温度55℃、固定化时间1h。对LX-1000EAPEGDGE固定化酶与游离酶、戊二醛(GA)交联LX-1000HA-GA的固定化酶进行酶学性质的比较,发现LX-1000EA-PEGDGE固定化酶较游离酶最适反应温度未改变,与LX-1000HA-GA相同的是最适反应pH都由7. 0提高为8. 0。在最适条件中所测LX-1000EA-PEGDGE酶活达到78. 84U/g,固定化改变了游离酶的酸碱耐受性,热稳定性和操作稳定性较游离酶和LX-1000HA-GA固定化酶均有提高。LX-1000EA-PEGDGE的热稳定表现优异,在60℃孵育3h后保留90%酶活;使用5次后仍能残余50%酶活;保存30天酶活仍保留60%。首次使用新型双环氧交联剂PEGDGE交联有机氨基载体共价结合固定化脂肪酶,为更有效的固定化方法提供了技术支持,同时也发现交联剂对固定化酶的性质存在较大影响。     

固定化原生质体生产葡萄糖氧化酶*

用溶壁酶处理对数生长前期的黑曲霉GP 024细胞,分离得到原生质体,再用光交联树脂包埋制备固定化原生质体,用于生产葡萄糖氧化酶。其胞外葡萄糖氧化酶的比产率几乎达到相应的游离细胞生产的胞内和胞外全部葡萄糖氧化酶的比产率。用光交联树脂制备的固定化黑曲霉细胞的产酶特性与游离细胞相似,而用溶壁酶处理过的固定化细胞的产酶特性与固定化原生质体相似。     

利用天然载体固定化活性干酵母细胞的研究

利用天然载体——蛋清固定化市售活性干酵母细胞,再经戊二醛进行共价交联而制备的具有高转化酶活力的新型粒状固定化生物催化剂,菌体包埋量大,活力回收高,机械性能好;特别是固定化生物催化剂经冷冻后,形成了均匀的多孔状颗粒,而酶活力基本不变,机械性能增强之特性．活性干酵母固定化后,其动力学特性表现为：K’m明显增大,热稳定性大大提高．于最适条件下,连续批次搅拌反应达两个月,凝胶颗粒无细胞渗漏,表现出相当稳定的酶活力．     

固定化根霉发酵生产脂肪酶

以聚氨酯为少根根霉固定化载体,对固定化后的细胞连续重复批次发酵进行了研究。优化了重复批次发酵培养基组成。在取代发酵液40mL,取代培养基组成为全脂豆粉3%,花生油0.5％条件下,固定化菌体摇瓶实验可连续使用140h,重复9批次。酶的时空产率提高6倍。5L发酵罐小试固定化菌体可连续发酵6批次。固定化细胞连续发酵,大大缩短了发酵的时间,酶的时空产率获得大幅提高。     

聚氨酯泡沫固定产脂肪酶粗状假丝酵母（Candidav alida T2）细胞的研究

对聚氨酯泡沫固定产脂肪酶粗状假丝酵母（Candida validaT2）细胞的固定化条件进行了研究。实验结果表明,聚氨酯泡沫颗粒经密度和粒径筛选,酸碱处理,以及固液比优化,载体固定细胞干质量比达到157lmg／g,细胞脂肪酶的酶活为每克干细胞1415U。电镜图片显示粗状假丝酵母菌（Candida validaT2）在载体孔隙内和脊壁上缠绕充盈,生长良好,固定结构稳定。固定化细胞连续催化水解桐籽油5批次,细胞相对水解酶活保持率达73％,固定细胞的损失率为12．5％。固定化细胞颗粒显示出良好的操作稳定性和酶活保持率,为进一步的应用研究提供了实验基础。     

壳聚糖固定化真菌漆酶及其用于处理酚类污染物的研究

Trametessp. AH282在液体培养条件下经邻甲苯胺诱导能有效合成漆酶同工酶A。以壳聚糖为载体,戊二醛为交联剂进行了漆酶A的固定化研究,确定酶固定化适宜条件为：0.1g壳聚糖与15 mL 5%戊二醛交联8 h后,加入30.0U酶固定12h。在此条件下获得的固定化漆酶催化能力为176.4U/g载体,酶活回收率58.5%。与游离酶相比,固定化漆酶与作用底物愈创木酚的亲和力降低,但固定化酶的稳定性有明显改善。固定化漆酶的最适温度为55℃,比游离酶提高5℃;70℃条件下保温8 h,固定化酶保留酶活56.5%,而在相同条件下游离酶酶活明显下降。使用固定化漆酶反应装置进行酚类化合物转化实验,连续进行12批次操作,固定化酶酶活仍保持60%以上,漆酶使用效率明显提高。     

聚氨酯泡沫固定产脂肪酶粗状假丝酵母(Candida valida T2)细胞的研究

对聚氨酯泡沫固定产脂肪酶粗状假丝酵母(Candida valida T2)细胞的固定化条件进行了研究.实验结果表明,聚氨酯泡沫颗粒经密度和粒径筛选,酸碱处理,以及固液比优化,载体固定细胞干质量比达到1571 mg/g,细胞脂肪酶的酶活为每克干细胞1415 U.电镜图片显示粗状假丝酵母菌(Candida valida T2)在载体孔隙内和脊壁上缠绕充盈,生长良好,固定结构稳定.固定化细胞连续催化水解桐籽油5批次,细胞相对水解酶活保持率达73%,固定细胞的损失率为12.5%.固定化细胞颗粒显示出良好的操作稳定性和酶活保持率,为进一步的应用研究提供了实验基础.     

环氧交联剂和氨基载体固定化海洋假丝酵母脂肪酶*

游离酶经过固定化后,稳定性和环境耐受性得到提高,在食品、医药、化工、环境和皮革等领域可以很好的提高酶的利用率并降低生产成本,具有极大的应用潜力。新型交联剂在固定化酶工艺的应用极大推进了固定化酶研究的深入。借助新型交联剂聚乙二醇二缩水甘油醚(PEGDGE),利用氨基载体LX-1000HA固定化海洋假丝酵母脂肪酶,结合单因素和正交试验优化得到交联及固定化条件为:交联温度30℃,交联2h,交联剂浓度0.75%,pH7.0,加酶量800U,载体量0.5g,固定化2h,固定化温度45℃。根据上述最佳固定化工艺,制备得到固定化酶LX-1000HA-PEGDGE-CRL在最适条件下测得酶活达到160.81U/g,约为此前制备的固定化酶LX-1000HA-GA-CRL(由LX-1000HA和戊二醛交联脂肪酶得到)和LX-1000EA-PEGDGE-CRL(由短链氨基载体LX-1000EA和PEGDGE交联脂肪酶得到)酶活的2倍,发现固定化酶LX-1000HA-PEGDGE-CRL的最适反应温度相比于游离酶提高15℃;在70℃的环境中3h后酶活仍存留70%;循环使用6次后残留65%左右的酶活;酸碱耐受性和储存稳定性也表现良好,4℃保存30天后剩余约70%的初始酶活。同时,将制备的固定化酶LX-1000HA-PEGDGE-CRL与游离酶、固定化酶LX-1000HA-GA-CRL、固定化酶LX-1000EA-PEGDGE-CRL进行了比较,发现固定化酶LX-1000HA-PEGDGE-CRL在温度耐受性和重复使用性等方面具有更好的使用效果。     

壳聚糖载体的制备及脲酶的固定化研究

以甲壳素为原料,制备出壳聚糖载体,并对脲酶进行固定化。通过测量悬挂醛基探讨了交联条件对载体性能的影响,优化了脲酶的固定化条件,研究了固定化酶的酶学性质,并与游离酶进行了比较。结果表明。制备载体的最优条件是将微球用6％的戊二醛活化2h,最佳联酶条件是载体与脲酶共反应1h。该固定化酶的最适温度为65℃,最适pH值为6．6,米氏常数为0．009mol／L,较游离酶均有较大改善。热稳定性较游离酶有很大的提高,且具有良好的操作稳定性。     

海藻糖合成酶活性受固定化处理过程影响的研究*

在麦芽糖苷基海藻糖合成酶(MTSase)和麦芽糖苷基海藻糖水解酶(MTHase)双酶的作用下,淀粉可转化为海藻糖,但是其转化率较低。中采用多种固定化载体进行酶固定化研究,发现通过经戊二醛与壳聚糖交联后的载体与酶液作用,可吸附与海藻糖合成无关的杂酶和杂质,从而提高海藻糖合成酶的活性。通过比较固定化过程中与反应条件中多个因素的影响,得到了如下最佳作用条件：将酶液与经3％戊二醛交联18h后的滤纸作用18h,再与10％的淀粉溶液反应9h,与未经固定化作用比较,海藻糖的产率提高10倍,达到27．22g／L转化率从5．33％提升到54．43％。     

采用渗透交联固定化方法提高细菌内酶转化率的研究

采用渗透交联方法处理固定化棒状杆菌,并利用细胞内酶顺式环氧琥珀酸水解酶催化生产L（＋）酒石酸。确定了最佳渗透交联固定化条件：多乙烯多胺浓度1．25％,作用30min;戊二醛浓度0．75％,作用15min,固定化细胞内酶转化的最适条件,底物浓度为0．5－1．0mol/L;pH8.0;温度37－42℃。结果发现,经渗透交联处理的固定化细胞酶活力比未处理的提高5倍多。而且固定化细胞的颗粒更度提高10倍多,保存期也有较大提高。     

以Fe(III) 改性胶原纤维为载体固定过氧化氢酶

将胶原纤维用三价铁改性后作为载体,通过戊二醛的交联作用将过氧化氢酶固定在该载体上。制备的固定化过氧化氢酶蛋白固载量为16.7 mg/g,酶活收率为35％。研究了固定化酶与自由酶的最适pH、最适温度、热稳定性、贮存稳定性及操作稳定性。结果表明：过氧化氢酶经此法固定化后,最适pH及最适温度与自由酶相同,分别为pH 7.0和25 ℃;但固定化酶的热稳定性显著提高,在75 ℃保存5 h后,仍能保留30％的活力,而自由酶则完全失活;固定化酶在室温下保存12 d后,酶活力仍保持在88％以上,而自由酶在此条件下则完全失     

固定化对酵母细胞发酵产ATP能力的影响

通过试验对酵母菌细胞的固定化方法及固定化酵母细胞在发酵生产ATP方面的应用进行了探讨。综合固定化颗粒的性能指标(粒径、弹性和机械强度)和发酵产ATP的能力,通过正交试验对酵母菌细胞的包埋条件进行了优化,确定了固定化酵母细胞的较优组合为聚乙烯醇3.5%、海藻酸钠2%、CaCl23%及交联时间6h,发酵后ATP含量最高,达到0.716g/L。进一步发酵条件的试验证实,固定化能提高酵母菌细胞对温度适应范围,延长发酵生产周期,从而提高菌体的利用率。     

一种固定化酶的新载体——对氨基苯砜乙基(ABSE-)交联琼脂

1.8%琼脂经环氧氯丙烷交联后,在碱性条件下与对β-硫酸酯乙砜基苯胺(SESA)反应制得了对氨基苯磺酰乙基-(ABSE)-交联琼脂。醚化反应最适pH是10。控制SESA加入量制得含有107～1216微克分子苯胺基/克干重琼脂载体。2.ABSE-交联琼脂经重氮化后可在pH6.4～8.0偶联核酸酶P_1,每克琼脂可结合105～120毫克核酸酶P_1,固定化酶活力为4280单位/克干重固定化酶。活力回收可达18～35%。3.偶联时硫酸铵的存在可稍微提高固定化核酸酶P_1的活力,但其稳定性却比对照的差。4.载体上苯胺基含量过多会不利于所固定化的酶显示活力,用α-萘酚封闭残留的苯胺基,可以明显增加固定化酶的稳定性。     

一种固定化酶的新载体——对氨基苯砜乙基(ABSE-)交联琼脂

1.8%琼脂经环氧氯丙烷交联后,在碱性条件下与对β-硫酸酯乙砜基苯胺(SESA)反应制得了对氨基苯磺酰乙基-(ABSE)-交联琼脂。醚化反应最适pH 是10。控制SESA 加入量制得含有107～1216微克分子苯胺基/克干重琼脂载体。2.ABSE-交联琼脂经重氮化后可在pH6.4～8.0偶联核酸酶P_1,每克琼脂可结合105～120毫克核酸酶P_1,固定化酶活力为4280单位/克干重固定化酶。活力回收可达18～35%。3.偶联时硫酸铵的存在可稍微提高固定化核酸酶P_1的活力,但其稳定性却比对照的差。4.载体上苯胺基含量过多会不利于所固定化的酶显示活力;用α-萘酚封闭残留的苯胺基,可以明显增加固定化酶的稳定性。     

壳聚糖酶产生菌的筛选及固定化细胞产酶

旨在筛选得到一株壳聚糖酶产生菌,并研究固定化细胞产酶的条件。在培养基中以壳聚糖为唯一碳源,对土壤样品进行筛选,获得一株无花果沙雷氏菌(Serratia ficaria CH-0203),该菌可被壳聚糖诱导产生壳聚糖酶。固定化细胞产酶的研究结果表明,多孔玻璃可以有效吸附CH—0203菌细胞。在最适发酵条件下(pH6．5,培养基与载体的总体积48ml,载体与培养基的比例为1．5g/4．0ml,吸附时间是20h-26h),发酵液酶活达到4．5U／ml,比游离细胞发酵提高了16％。采用半连续发酵的方式,固定化的细胞可以稳定发酵产酶120h左右。固定化细胞产酶的效率大大高于游离细胞。     

帆布固定化脂肪酶及其性能的研究

研究了用高碘酸钠氧化帆布纤维,使其纤维衍生化成为醛基,与脂肪酶交联进行固定化的过程。通过醛基被交联程度来评价交联过程的优劣。首先对纤维的氧化过程进行了简单优化,进而通过反复交联法与酶蛋白交联。以大豆油和橄榄油水解作为固定化酶的性能评价指标。实验结果表明,通过采用反复交联的方法,可提高载体表面酶蛋白质量分数30％左右。酶活力平均达到4U／cm^2,其对温度、pH的耐受性相比游离酶均有不同程度提高。同时利用油脂在固定化酶过程对酶进行保护,使其对温度、pH等的耐受性进一步增强。在维持较高水解率条件下,可在温和条件下连续反应7批,反应半衰期达140h以上。     

利用渗透交联固定化细胞促进生物转化

固定化技术已在生物工程中得到广泛的实际应用,特别是应用于生物转化以提高酶或细胞的稳定性,实现连续操作等。对于含胞内酶的细胞的生物转化．一般先破碎细胞,使酶释放出来,再进行酶固定化。由于酶的稳定性通常与细胞膜的结台有关^[1],细胞破碎中常导致酶的失活。如果不破碎细胞,对完整细胞固定化,又会有传质困难抑制酶活力的发挥。我们研究出渗透交联固定化细胞技术以解决这个矛盾。先采用某种试剂(多为表面活性剂)处理细胞,提高细胞的通透性,再进行交联固定化．可以保证酶的活力破坏较小,又减小了传质阻力。既提高了固定化细胞的稳定性,又提高了固定化细胞的表观酶活。称这种固定化技术为渗透交联固定化细胞技术。Prabhuaney等采用CTAB-戊二醛处理聚丙烯酰胺凝胶包理的含青霉素酰化酶E. coli细胞^[2]。Nmhida采用1,6-己二胺-戊二醛处理含天冬氨酸酶的E．Coli细胞^[3]。渗透交联固定化处理会损伤细胞和酶是这种技术的一个矛盾。本文采用多乙烯多胺-戊二处理方法．因多乙烯多胺既起到表面活性剂的作用．又是交联剂。而且渗透能力比CTAB和1,6-已二 胺为低,故对细胞和酶损伤较小。