猪细小病毒VP2蛋白在干酪乳杆菌表面的表达

将编码猪细小病毒主要免疫保护性抗原VP2基因插入干酪乳杆菌细胞表面表达载体pPG中,构建了重组表达载体pPG-VP2,将其电转化干酪乳杆菌Lactobacillus casei 393,获得了表达猪细小病毒VP2蛋白的重组干酪乳杆菌系统,经2%乳糖在MRS培养基中的诱导表达,SDS-PAGE检测表明,有约74kD蛋白得到了表达,表达蛋白的大小与理论值相符。Western-blot结果分析表明,表达的蛋白可被鼠源PPV抗血清所识别,间接免疫荧光实验结果表明,所表达的蛋白能够在干酪乳杆菌菌体表面检测到。     

猪瘟病毒T细胞表位E290多肽与猪细小病毒VP2蛋白在干酪乳杆菌中的共表达及免疫小鼠特异性抗体的测定

将分别编码猪瘟病毒T细胞表位E290多肽和猪细小病毒主要保护性抗原VP2蛋白的重组基因插入干酪乳杆菌分泌型表达载体pPG中,构建了重组表达载体pPG-VP2-E290,将其电转化干酪乳杆菌Lactobacillus casei 393,获得了猪瘟病毒T细胞表位E290多肽与猪细小病毒VP2蛋白的乳酸菌共表达系统,经2%乳糖在MRS培养基中的诱导表达,对诱导表达的菌体及培养上清液进行SDS-PAGE检测表明,有约70kDa蛋白得到了表达,表达蛋白的大小与理论值相符。Western blot分析结果表明所表达的蛋白具有与天然病毒蛋白一样的抗原特异性。以诱导表达上清液作为抗原进行的间接ELISA实验也表明,重组的目的蛋白获得了分泌表达。将该重组干酪乳杆菌经口服接种途径免疫BALB/c小鼠,收集粪便样品检测小鼠产生抗PPV的特异性sIgA抗体,采集血液样本检测血清中抗PPV及抗E290的特异性IgG。结果表明分泌型的重组菌pPG-VP2-E290/L.casei 393免疫小鼠能够产生明显的抗体水平,为重组猪瘟与猪细小病毒乳酸菌口服活菌疫苗的研制奠定了重要的物质基础。     

猪细小病毒VP2蛋白在昆虫细胞中的表达及其特性

将猪细小病毒(Porcine Parvovirus, PPV)vp2基因重组到杆状病毒BacToBac表达系统的pFastBacⅠ质粒中,构建了pFastvp2质粒。在DH10Bac大肠杆菌中,pFastvp2与改造过的苜蓿夜蛾核型多角体病毒(AcNPV)基因组(Bacmid)发生同源重组,从而获得重组穿梭载体Bacmidvp2,转染Sf9细胞得到重组病毒AcNPVvp2。SDSPAGE和Westernblotting分析可见大小约为64kD的特异性带,表明AcNPVvp2在Sf9细胞中成功地表达了PPV VP2蛋白。红细胞凝集试验和间接ELISA进一步证实,表达的VP2蛋白具有与全病毒相同的血凝活性和相似的抗原性。电镜观察VP2蛋白的粗提物,发现VP2蛋白可自行装配成许多病毒样粒子(VLPs)。     

犬瘟热病毒抗原表位T’TB和犬细小病毒VP2蛋白的共表达及免疫小鼠特异性抗体的测定

应用PCR方法扩增犬细小病毒VP2基因,将其克隆至Bac-to-Bac杆状病毒表达系统中的转移载体pFastBacHTc上,命名为pFastBacHTc-VP2,将人工合成的犬瘟热病毒抗原表位基因T'TB克隆至VP2基因的上游,命名为 pFastBacHTc-T'TB-VP2.进而转化含穿梭载体Bacmid的感受态细胞DH10Bac中,获得携带犬瘟热病毒T'TB细胞表位和犬细小病毒VP2基因的重组转染质粒Bacmid-BacHT-T'TB-VP2,将其转染昆虫细胞Sf-9后获得融合重组T'TB-VP2蛋白,大小约为70 ku.经Western blot分析,结果显示:表达的蛋白具有良好的免疫原性.表达的重组蛋白在无佐剂参与的情况下,按确定的免疫程序免疫6～8周龄的BALB/c小鼠,检测小鼠的体液免疫学指标.结果表明:表达蛋白能诱导小鼠产生抗CDV和CPV的特异性中和抗体.本实验为重组犬瘟热与犬细小病毒新型亚单位疫苗的研制奠定了重要的物质基础.     

大肠杆菌 LT B亚基基因表达载体对犬细小病毒VP2 DNA疫苗免疫应答的增强作用

【目的】通过融合基因表达载体和共免疫基因表达载体研究大肠杆菌不耐热肠毒素(LT)B亚基基因对犬细小病毒VP2DNA疫苗免疫应答的影响。【方法】提取大肠杆菌44815菌株基因组DNA,通过PCR方法从基因组DNA中扩增LTB基因,同时采用PCR方法从含有犬细小病毒VP2基因的质粒中扩增VP2的主要抗原表位基因(VP2-70,编码70个氨基酸)。将上述基因分别连接到含有人CD5信号肽序列的载体pcDNA-CD5sp上,分别构建成它们的分泌型真核表达载体,pcDNA-CD5sp-LTB和pcDNA-CD5sp-VP2-70。再利用酶切连接的方法构建LTB与VP2-70融合的真核表达载体pcDNACD5sp-LTB-VP2-70。然后用pcDNACD5sp-VP2-70(VP2-70组)、pcDNACD5sp-LTB-VP2-70(VP2-LTB融合组)、pcDNA-CD5sp-LTB/pcDNACD5sp-VP2-70(VP2-LTB共免疫组)和pcDNA3.1A(空载体对照组)分别免疫小鼠。免疫后用间接ELISA检测不同时间小鼠血清的抗体水平,用MTT方法检测小鼠免疫5周后脾脏淋巴细胞的增殖活性。【结果】经过测序表明本研究扩增的LTB和VP2基因序列和构建的相关表达载体结构正确。通过Western-blot检测证明构建的表达载体均能介导相应基因在真核细胞进行分泌表达。ELISA检测结果表明,3组实验组小鼠接受VP2DNA疫苗免疫后均能产生特异的体液免疫应答反应,特别是VP2-LTB基因融合组小鼠的抗体水平在第5周时高达1:5120,明显高于其它两组(P<0.01)。3组免疫小鼠抗体的亚型均表现IgG1抗体水平明显高于IgG2a抗体水平(P<0.01)。淋巴细胞增殖实验结果表明,在ConA的刺激下,3组免疫小鼠的淋巴细胞刺激指数均明显高于对照组(P<0.01),说明VP2DNA疫苗能够引起淋巴细胞的增殖。但3组免疫小鼠之间的刺激指数没有明显差异(P>0.05)。【结论】在小鼠体内,LTB基因表达载体可明显提高CPVVP2DNA疫苗的体液免疫应答水平。     

表达猪细小病毒VP2基因的重组伪狂犬病毒的构建及其生物学特征研究

根据Bergeron等报道的猪细小病毒(PPV)基因组,设计一对包含VP2全基因的PCR引物,上下游均引入一个BamHI位点,扩增得到VP2基因后,将其插入到pUSK载体中,构建了转移载体pUSK-VP2.采用脂质体介导的转染方法,将伪狂犬病毒TK-/gG-/LacZ 株的基因组DNA与pUSK-VP2共转染PK-15细胞,待细胞病变后收集病毒液,在空斑纯化的同时,利用检测PPV VP2基因和LacZ基因的PCR方法筛选重组病毒TK-/gG-/VP 2株,Southern blotting、SDS-PAGE、Western blotting和电镜观察鉴定重组病毒,并在不同细胞上测定重组病毒的增殖滴度,接种小鼠进行安全性试验.结果发现,外源基因VP2已成功地插入到TK-/gG-/LacZ 亲本株的基因组中,并获得了表达.表达的VP2蛋白可以与猪细小病毒阳性血清反应,而且可以自行装配成病毒样颗粒.同时发现,VP2基因的插入不影响重组病毒的增殖特性,其毒力与亲本株相当.     

犬细小病毒VP2蛋白在真核细胞中的分泌表达及特性

摘要:【目的】利用真核细胞分泌表达犬细小病毒VP2蛋白和研究其特性。【方法】为构建犬细小病毒（Canine parvovirus, CPV）VP2基因的真核分泌型表达载体,首先通过酶切从含有人CD5信号肽序列的质粒中将CD5信号肽基因片段切出,将其连接到真核表达载体pcDNA3.1A的多克隆位点上,构建成pcDNA3.1-CD5sp质粒。然后再通过PCR方法从含有犬细小病毒VP2基因的质粒中扩增VP2基因,并将其插入到pcDNA3.1- CD5sp载体中CD5信号肽的下游,构建成VP2基因的真核分泌型表达载体pcDNA-CD5sp-VP2。经磷酸钙介导转染293T细胞,使其在真核细胞中进行分泌表达,并通过ELISA检测表达的VP2蛋白与犬转铁蛋白受体（TfR）结合的活性。【结果】序列分析结果表明,本实验构建的犬细小病毒VP2基因真核分泌型表达载体结构正确,将该表达载体转染的293T细胞,在培养基中通过Western-blot检测到有VP2重组蛋白的存在。经ELISA检测表明表达的重组VP2蛋白具有与犬转铁蛋白受体结合的活性。【结论】 利用人的CD5信号肽实现了犬细小病毒VP2蛋白在真核细胞中的分泌表达,表达的VP2蛋白具有与犬转铁蛋白受体结合的活性。     

猪细小病毒核酸疫苗的构建及其对小鼠免疫原性的研究

将猪细小病毒VP2基因克隆至pCI-neo真核表达载体中,构建了pCIneo-VP2重组质粒,转染至PK-15细胞中,利用免疫荧光方法检测在体外表达情况;并以小鼠为动物模型,将pCIneo-VP2、pCI-neo重组质粒、猪细小病毒活疫苗和对照组通过肌肉注射进行免疫,检测免疫小鼠的淋巴细胞转化功能,特异性CTL杀伤活性和血清抗体滴度。结果显示,pCIneo-VP2在体外能够诱导PK-15细胞表达VP2蛋白,小鼠注射pCIneo-VP2质粒 1周后能够诱导机体产生抗体,4周时达到峰值,与活疫苗对照组产生的抗体滴度、诱导T淋巴细胞增殖和诱导强的细胞毒性基本一致。试验表明,构建的pCIneo-VP2能够有效诱导机体产生体液免疫和细胞免疫,为研制出高效、新型猪细小病毒疫苗提供了科学依据和试验依据。     

猪水泡病病毒VP1基因的克隆和表达

以猪水泡病病毒RNA为模板,应用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,扩增了849bp的VP1基因,通过T-A克隆技术,将VP1基因片段克隆至pMD18-T克隆载体质粒中,构建SVDVVP1基因克隆重组质粒,进行核苷酸序列分析。然后亚克隆插入pBAD/ThioTOPO表达载体,经测序鉴定,筛选获得VP1基因正向插入、有正确读码框的阳性克隆,成功构建了猪水泡病病毒VP1基因重组表达载体。经L-Arabinose诱导表达,可稳定、高效地表达VP1蛋白抗原。SDS-PAGE结果表明,以终浓度为0.002%的L-阿拉伯醛糖进行诱导,5h后表达可达到高峰,表达蛋白为融合蛋白,质量约47.13kDa,表达产量约占菌体总蛋白的16%。Westernblotting检测表明,诱导的蛋白能与猪水泡病阳性血清发生特异性反应。融合蛋白中含有猪水泡病病毒VP1蛋白抗原,为应用该表达蛋白抗原制备SVD免疫血清学诊断试剂和新型疫苗构建奠定基础。     

轮状病毒VP4抗原表位在VP6载体蛋白同一位点表达比较研究

目的:评价轮状病毒(RV)VP4两个抗原表位插入VP6载体蛋白同一位点所表达的重组嵌合蛋白免疫学性质及在研制嵌合蛋白疫苗中的意义。方法:采用分子克隆和基因重组技术将RV VP4的两个抗原表位插入到VP6载体蛋白同一位点上,构建重组抗原表达质粒,表达携带不同抗原表位的重组嵌合蛋白,用Western blot和中和试验分析重组嵌合蛋白的抗原反应性和免疫原性。结果:成功构建了两个嵌合蛋白表达质粒,并在大肠杆菌中高效表达;表达的嵌合蛋白可与相应抗体特异性反应;可诱导豚鼠产生特异性血清抗体;抗嵌合蛋白血清抗体可特异性识别载体蛋白VP6F,Wa株病毒的VP6和VP4蛋白,可中和Wa株病毒在MA104细胞上的感染性;结果表明,所构建和表达的两个以VP6为载体的VP4抗原表位嵌合蛋白具有较高抗原反应性和免疫原性;嵌合蛋白携带的VP4抗原表位具有增强载体蛋白免疫原性作用;为研制新型RV重组蛋白疫苗的奠定了较好的基础。     

表面表达猪流行性腹泻病毒核蛋白蛋白的重组干酪乳杆菌诱导产生的免疫应答

为探讨表达猪流行性腹泻病毒(PEDV)核蛋白(N)基因的重组干酪乳杆菌口服免疫小鼠后诱导特异性免疫应答,本研究制备表达流行性腹泻病毒核蛋白的重组干酪乳杆菌,应用Western blotting、间接免疫荧光和全细胞ELISA鉴定目的蛋白的表达。然后用该重组干酪乳杆菌口服免疫BALB/c小鼠,分别测定了免疫后不同时间血清中特异性IgG、粪便中特异性的sIgA水平以及血清的中和活性;并测定免疫小鼠脾淋巴细胞增殖情况和细胞因子水平。结果显示,目的蛋白表达在细胞表面,可被阳性血清所识别。免疫小鼠后,可分别在血清中和粪便中检测到较高水平特异性IgG、sIgA(P<0.01),但血清并没有中和活性;淋巴细胞增殖试验和细胞因子测定结果显示,免疫组可产生明显的细胞免疫应答。结果表明,该重组干酪乳杆菌表达系统可诱导小鼠产生黏膜免疫应答和系统免疫应答,具有作为口服疫苗潜在的应用价值。     

表达重组猪瘟病毒E290多肽的干酪乳杆菌口服免疫特性及诱导特异性CTL反应的研究

经PCR扩增获得约60bp编码猪瘟病毒T细胞表位E290多肽基因片段,克隆至表达载体pPG-VP2中VP2基因5′端上游,命名为pPG-VP2-E290,电转化干酪乳杆菌,构建了表达猪瘟病毒E290多肽的重组乳酸菌系统。口服免疫BALB/c鼠和新西兰兔,检测诱导小鼠和兔体内产生特异性抗猪瘟病毒E290多肽IgG水平,并对E290多肽的CTL活性进行检测,同时对免疫兔进行猪瘟病毒攻毒实验,检测E290多肽抗体对免疫兔的保护作用。构建的重组猪瘟病毒T细胞表位的干酪乳杆菌具有良好的免疫性,口服免疫后的小鼠和兔血清中均检测到了较高水平的抗E290多肽抗体IgG,且能诱导小鼠机体产生抗猪瘟病毒的特异性CTL反应,亦证实猪瘟病毒E290免疫兔能够抵抗猪瘟病毒的攻击。     

Induction of immune responses in mice after intragastric administration of Lactobacillus casei producing porcine parvovirus VP2 protein

Lactobacillus casei ATCC 393 was selected as an antigen delivery vehicle for mucosal immunization against porcine parvovirus (PPV) infection. A 64-kDa fragment of PPV major protective antigen VP2 protein was used as the parvovirus antigen model. A recombinant Lactobacillus expressing VP2 protein was constructed with plasmid pPG611.1, where expression and localization of the VP2 protein from recombinant Lc393-rPPV-VP2 was detected via sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis, Western blotting, and immunofluorescence. Both local mucosal and systemic immune responses against PPV were induced in BALB/c mice immunized orally with the recombinant Lactobacillus expressing VP2 protein. The induced antibodies demonstrated neutralizing effects on PPV infection. These data indicated that the use of recombinant lactobacilli could be a valuable strategy for future vaccine development of PPV.     

Induction of Immune Responses in Mice after Intragastric Administration of Lactobacillus casei Producing Porcine Parvovirus VP2 Protein

Lactobacillus casei ATCC 393 was selected as an antigen delivery vehicle for mucosal immunization against porcine parvovirus (PPV) infection. A 64-kDa fragment of PPV major protective antigen VP2 protein was used as the parvovirus antigen model. A recombinant Lactobacillus expressing VP2 protein was constructed with plasmid pPG611.1, where expression and localization of the VP2 protein from recombinant Lc393-rPPV-VP2 was detected via sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis, Western blotting, and immunofluorescence. Both local mucosal and systemic immune responses against PPV were induced in BALB/c mice immunized orally with the recombinant Lactobacillus expressing VP2 protein. The induced antibodies demonstrated neutralizing effects on PPV infection. These data indicated that the use of recombinant lactobacilli could be a valuable strategy for future vaccine development of PPV.     

表面展示新城疫病毒部分F蛋白的重组干酪乳杆菌的构建及其免疫原性

本研究旨在构建重组干酪乳杆菌pLA-Newcastlediseasevirus (NDV)-F/Lactobacillus casei,获得表达产物,并探讨其免疫效果。利用PCR扩增携带部分主要抗原表位的NDV F基因,与穿梭质粒pLA连接转化至大肠杆菌BL21 (DE3)中,筛选阳性重组质粒,将其电转化至干酪乳杆菌中,构建重组干酪乳杆菌pLA-NDV-F/L. casei,应用PCR鉴定阳性菌株,Western blotting鉴定重组菌反应原性,间接免疫荧光、流式细胞术和激光共聚焦检测蛋白表达情况。试验选用14日龄雏鸡,各组免疫方式为口服+滴鼻。设立pLA-NDV-F/L. casei两次免疫组和三次免疫组、弱毒疫苗组、 pLA/L.casei、未攻毒PBS组和攻毒PBS组。间接ELISA方法检测雏鸡血清IgG、肠道、鼻腔、肺脏中sIgA抗体效价,评价试验组雏鸡攻毒保护率。结果表明,有94.10%的重组菌表达了F蛋白,且高效表达在干酪乳杆菌细胞表面,蛋白大小为62kDa,并能与抗NDV阳性血清特异性结合。各免疫组anti-F IgG和s Ig A抗体水平显著高于对照组,p LA-NDV-F/L. casei三次免疫组抗体持续时间比两次免疫组延长28 d,抗体峰值没有显著差异。免疫pLA-NDV-F/L. casei三次、两次、弱毒疫苗、pLA/L. casei和PBS的攻击保护率分别为80%、80%、90%、0%和0%。因此,利用干酪乳杆菌表达体系成功表达了携带部分抗原表位的NDVF基因,具备良好的反应原性和免疫原性,可诱导机体产生保护性免疫应答。     

大肠埃希菌热不稳定肠毒素B亚单位在婴儿双歧杆菌中的表达

目的将大肠埃希菌热不稳定肠毒素B亚单位（LTB）克隆到表达载体pBV220,使LTB基因在大肠埃希菌和双歧杆菌中稳定表达。方法将LTB基因克隆到表达载体pBV220中,再分别转化大肠埃希菌DH5a和婴儿双歧杆菌,使之表达,表达产物用SDS—PAGE鉴定。并通过家兔肠袢实验验证表达蛋白的安全性。结果LTB基因在大肠埃希菌和双歧杆菌中均可稳定表达,毒性实验证明LTB保留轻微的毒性。结论稳定表达LTB的双歧杆菌为今后的口服疫苗佐剂奠定了基础。     

重组GFP干酪乳杆菌的构建及其在小鼠肠道内的定植分布

【目的】研究重组干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)在小鼠肠道内定植能力及分布规律。【方法】利用绿色荧光蛋白(GFP)基因作为报告基因,构建pgsA基因与GFP的融合基因载体pLA-GFP,电转化到乳酸杆菌中,得到阳性重组菌。将重组菌以每只109mL-1的量,口服接种SPF级BALB/c小鼠,分别于口服后的1.5h、3h、12h、1d、3d、5d、6d、7d之后取其十二指肠、空肠、回肠、盲肠的肠道冲洗液,通过平板菌落计数法检测肠道内的重组干酪乳杆菌。【结果】Western blot结果显示约69kDa的融合蛋白在乳酸菌中得到了正确的表达;重组菌在蓝紫光激发下,发出绿色荧光。小鼠口服重组菌后能在肠道黏膜的不同部位以一定的比例存活并附着在肠黏膜表面,口服6d后达到定植高峰期,7d后在十二指肠、空肠、回肠和盲肠定植率分别占第1天的16.49%、25.08%、47.71%、41.03%。【结论】GFP在干酪乳杆菌中得到了稳定的表达,且在小鼠肠道内具有良好的定植能力,定植规律回肠盲肠空肠十二指肠,这为研究乳酸杆菌作为口服疫苗抗原递送载体及其对小鼠肠道免疫机理提供试验基础。