重组人RGD-sTRAIL的表达、纯化及抗肿瘤活性研究

利用PCR技术构建RGD短肽与人肿瘤坏死因子凋亡配体(胞外区114-281)的融合基因,将该DNA片段克隆到原核表达载体pET-11a中。重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导后可表达相对分子质量约为20000的目的蛋白,占菌体蛋白的20％左右,且大多数重组蛋白以不溶的包涵体形式存在。Western印迹表明目的蛋白具有人sTRAIL的抗原性。表达产物经变性、复性、离子交换层析和分子筛等步骤,可以得到纯度大干95％的RGD-sTRAIL重组蛋白。肿瘤细胞体外实验发现,纯化后的RGD-sTRAIL重组蛋白能明显抑制人肺癌细胞A549生长,并呈剂量依赖性。研究结果表明,通过复性,包涵体中的RGD-sTRAIL蛋白得到正确的折叠,并在体外具有杀伤肿瘤细胞的活性,从而为进一步研究体内靶向性杀伤肿瘤细胞奠定了基础。     

抗CEA免疫毒素的表达、纯化、复性与生物学活性的研究

以抗癌胚抗原（Carcinoembryonic antigen, CEA）单链抗体与假单胞菌外毒素（Pseudomonas exotoxin A, PEA）的截短和修饰形式PE38/KDEL构建重组免疫毒素CEA/PE38/KDEL,并在大肠杆菌菌株BL21(DE3)-star中表达。采用镍离子螯合层析法纯化变性的包涵体样品,并用连续梯度透析的方法对纯化后的包涵体进行复性。采用流式细胞术鉴定复性产物与靶细胞的结合活性,结果表明免疫毒素CEA/PE38/KDEL具有与靶细胞特异性结合的活性。以MTT法检测免疫毒素对肿瘤细胞的体外杀伤活性,结果表明该免疫毒素对SW1116和CNE_2细胞具有特异性杀伤活性。证明了经包涵体复性的抗CEA免疫毒素CEA/PE38/KDEL对表达CEA抗原的肿瘤细胞具有良好的结合和杀伤活性。     

高纯度白介素-3与假单胞菌外毒素融合蛋白的表达、纯化及质谱鉴定

旨在利用简单的表达纯化工艺,获得纯度较高、有活性的重组免疫毒素IL3-PE38KDEL并对其物理学及免疫学性质进行鉴定。利用PQE30-IL3-PE38KDEL/SG12009工程菌表达重组免疫毒素IL3-PE38KDEL,在提取包涵体后经一步强阳离子柱层析得到纯度较高的免疫毒素复性纯化产物,用Westenblotting、质谱、氨基测序等先进技术对产物鉴定。结果显示,发酵后目的蛋白表达量占总菌体的17.56%,经强阳离子柱层析纯化复性后的目的蛋白纯度达到90%以上,Western blotting、质谱、氨基测序结果均表明,纯化产物分子量为54.9kD且具有相应的免疫学活性,序列与预期序列完全一致。纯化复性方法对重组免疫毒素IL3-PE38KDEL的生物性质及纯度有较大影响,因此选择一种适当的纯化复性方法至关重要。     

重组人胰激肽原酶复性工艺的研究

目的:研究重组人胰激肽原酶包涵体变性及复性的工艺。方法:对本实验室构建的重组人胰激肽原酶大肠杆菌进行IPTG诱导表达表达成功后,菌体经超声破碎释放包涵体,包涵体经洗涤、变性、稀释和尿素梯度凝胶过滤色谱这两种方法复性后(Sephadex-G75),通过测定酶活检验复性效果。结果:①重组人胰激肽原酶工程菌经过IPTG诱导后能够表达目的蛋白,目的蛋白以包涵体形式存在,将细胞破碎后,包涵体经过3次洗涤,纯度达到71.93%;②变性包涵体经24小时稀释复性后,蛋白浓度达到72.61μg/m L,酶的比活达到13.84 U/mg;③变性包涵体经过2个小时的尿素梯度凝胶过滤复性后,蛋白浓度可达到830.07μg/mL,酶的比活达到48.61 U/mg。结论:两种复性方法均可以使包涵体达到一定的浓度和比活,比较发现尿素梯度凝胶过滤色谱具有复性时间短和比活力高等优点,可作为重组人胰激肽原酶复性的一种有效的手段。     

p65蛋白的诱导表达及电子显微镜观察其显微结构

目的:构建重组原核表达载体pGEX-5x-1-p65,诱导GST-p65融合蛋白的表达并观察其包涵体的显微结构.方法:应用PCR技术扩增得到p65全长序列,并亚克隆至带有GST标签的pGEX-5x-1载体中.经酶切、测序鉴定后,在原核细胞中诱导表达GST-p65融合蛋白并将诱导后的菌体制作透射电镜标本,观察菌体内部显微结构.结果:成功构建表达载体pGEX-5x-1-p65,原核细胞中诱导表达、凝胶电泳后未见可溶性融合蛋白的高效表达.透射电镜观察到在承载有重组载体的菌体内部出现大量高电子密度的包涵体.结论:成功构建了原核表达载体pGEX-5x-1-p65,电子显微镜观察并证实在原核细胞内p65蛋白诱导表达形成包涵体.     

重组人Doppel蛋白的表达及其细胞毒性作用的研究

Doppel(Dpl)蛋白是新近发现的PrP相关蛋白.根据GenBank公布的人PRND cDNA序列设计合成特异性引物,用PCR方法从人外周血白细胞总DNA中扩增获得531 bp的人PRND完整基因序列,测序正确后克隆至表达载体,转化大肠杆菌JM109,IPTG诱导表达重组人Doppel(rhDpl)蛋白.目的蛋白以包涵体形式表达,表达量占菌体总蛋白的60%以上.表达产物用Ni2 亲和层析柱纯化及羟胺化学裂解法去除标签蛋白,SDS-PAGE检测证实,纯化的rhDpl蛋白相对分子量约为15 kD.Trypan Blue及MTT实验显示,在50μg/mL及以上剂量时,rhDpl蛋白具有抑制人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞生长的作用,在100μg/mL及以上剂量时,rhDpl具有杀伤HeLa细胞的活性,呈现明显的剂量和时间依赖性.Hoechst33342荧光染色观察显示经rhDpl作用的人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y呈现出细胞凋亡现象.这些结果提示Dpl蛋白具有体外细胞毒作用,并呈现明显的组织类型特异性.以上工作为进一步了解人Dpl蛋白体内外生物学作用奠定了基础.     

小鼠CSRP2基因的克隆、融合表达及蛋白的分离纯化

目的：获得小鼠CSRP2（cysteine rich protein2）基因片段,高效表达、纯化CSRP2。方法：用RT-PCR技术从小鼠心脏组织中提取总DNA并扩增出相应大小的CSRP2DNA片段,将其与pGEM—T—easy载体连接后测序,将测序正确的CSRP2从BamHⅠ和HindⅢ酶切位点克隆入原核表达载体pRSET—A,将连接产物转化大肠杆菌BL21,挑出阳性克隆,IPTG诱导表达重组的6xHis融合蛋白,对重组融合蛋白通过镍柱进行纯化。结果与结论：PCR获得的C职咫序列与GenBank报道的一致（为675bp）;重组载体在大肠杆菌BIJ21中以包涵体形式高效表达;融合蛋白经SDS—PAGE和Western blot分析,在相对分子质量约24×10^3处有特异的蛋白条带,目的蛋白表达量占菌体总蛋白量的25％;重组蛋白经镍柱纯化后,得到了高纯度的CSRP2融合蛋白。     

人白细胞介素18在大肠杆菌中的表达,纯化和复性

用ＲＴ－ＰＣＲ从ＰＨＡ刺激的人外周血单个核细胞（ＰＢＭＣ）中扩增出人白细胞介素１８（ＩＬ－１８）的ｃＤＮＡ,克隆到表达载体ｐＪＷ２中,经热诱导后在大脾性杆菌中得到高效表达。表达的重组ＩＬ－１８占菌体总局旧白质的２０％,表达的蛋白南分子量约为１８ＫＤ,与预期分子量相符。产物主要以包涵体的形式存在。包涵体经超声破碎、洗涤后以８ｍｏｌ／Ｌ尿素溶解,经Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－１００柱纯化后,纯度可达９０％以     

抗菌肽-X基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

用PCR技术获得抗菌肽—X基因、TNFα基因,与温度诱导的表达载体pRC连接成为重组表达载体,导入大肠杆菌TG1,通过温度诱导表达重组蛋白。将重组质粒转入不同的表达菌中进行表达,经SDS—PAGE选出E.coil BL21(DE3)为最佳表达的宿主菌。培养后,离心得菌体,经超声破碎离心得包涵体,溶解后用CNBr切割并透析,最后经CM52纤维素柱分离纯化得到有活性高纯度的抗菌肽—X。     

重组人IL-4大肠杆菌表达与纯化

根据大肠杆菌密码子偏爱性优化并合成人白细胞介素4基因,以pET30a( )为载体构建了重组表达质粒pET30a( )/rhIL-4,将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,诱导表达并超声破菌检测重组蛋白的表达形式。采用5L发酵罐培养工程菌,发酵液OD600为0.6时诱导3.5h收集菌体,检测目的蛋白的表达量。收集的菌体经压榨破菌获得包涵体,通过包涵体变性、层析、透析复性等方法对rhIL-4进行纯化。采用人红细胞白血病细胞(TF-1)测定纯化的rhIL-4的生物活性。测序表明目的基因已插入载体pET30a( )中,重组蛋白以包涵体形式表达,单位体积重组蛋白的表达量达200mg/L发酵液,建立了对包涵体形式表达的rhIL-4纯化方法,最终得率为40mg/L发酵液,纯度大于98%,回收率为20%以上。免疫印迹法检测诱导表达的重组蛋白和纯化的蛋白为IL-4,N端氨基酸序列测定结果与理论相符,生物活性检测纯化的蛋白比活性达2.5×106AU/mg。这为rhIL-4进一步产业化研究建立了基础。     

凋亡素融合蛋白的可溶性表达及活性分析

目的:构建PET-28a-SPA原核表达载体,在大肠杆菌BL21(DE3)中实现其高效可溶性表达,测定对肿瘤细胞的凋亡效果。方法:本实验在获得凋亡蛋白融合基因的基础上,成功地构建了重组表达质粒PET-28a-SPA,将阳性重组质粒转化表达受体菌BL21(DE3)感受态细胞中,经IPTG诱导表达,表达产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳检测和Western blot检测,并采用MTT法检测其对肿瘤细胞的增殖抑制。结果:表达产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳检测,凋亡蛋白融合基因获得高效表达,软件分析表明表达蛋白占菌体蛋白20%左右。上清表达量约为10%。上清蛋白经纯化后,Western blot结果显示,利用凋亡蛋白单克隆抗体可以很好地和所表达的蛋白带特异性结合,并且对A549肺癌细胞及Hela细胞具有一定的凋亡作用。结论:所获凋亡蛋白以高效胞质可溶形式表达,为其研制有效的肿瘤免疫治疗靶向药物提供一定的基础。     

胆汁三烯结合蛋白在大肠杆菌中的表达、复性与纯化

目的：合成胆汁三烯结合蛋白（BBP）基因并在大肠杆菌中表达,获得重组BBP纯化制品。方法：根据天然BBP的基因序列和大肠杆菌偏好密码子设计并合成BBP基因的引物,PCR扩增优化的BBP基因序列,克隆至载体pEasy-T3;测序正确后,将该序列克隆至表达载体pET-32a上,构建表达质粒,转化至大肠杆菌BL21（DE3）pLysS,在IPTG诱导下表达融合蛋白;采用Ni柱纯化融合蛋白。结果：PCR扩增获得了优化后的BBP基因序列,构建了表达载体pET-32a-BBP;SDS-PAGE分析表明表达的融合蛋白相对分子质量为20×10^3,以包涵体形式存在,占全菌蛋白的40%以上;变性、复性后经Ni2＋柱纯化,获得纯度达98%以上的重组蛋白。结论：优化并合成了BBP全基因序列,获得了高纯度重组融合蛋白,为进一步鉴定其生物活性及筛选小分子的研究奠定了基础。     

人vasorin蛋白的基因克隆、表达及纯化简

目的：克隆、表达人vasorin（VASN）蛋白。方法：利用PCR方法从HepG2细胞的cDNA中扩增获得目的基因,并插入带有6xHis标签的原核高效可溶性表达载体pET28a中,构建重组表达质粒pET28a-VASN,将重组表达质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）,经IPTG诱导后目的基因获得表达,对融合目的蛋白进行Ni^2＋金属螯合柱纯化。结果：内切酶鉴定及基因序列测定证实重组表达质粒构建成功;对目的蛋白进行了原核表达,SDS-PAGE显示相对分子质量为61x10^3的特异表达条带;Western印迹证实目的蛋白为VASN,且主要以包涵体形式存在;对经尿素变性的表达产物进行了亲和层析纯化,有利于以后的变性、复性过程。结论：获得了人VASN融合蛋白,为其进一步的生物学功能研究奠定了基础。     

IL-1023-57-PE40分泌表达的初步研究

将IL-1023-57-PE40基因与pelB信号肽融合置于pET-20b构建分泌表达质粒pET-20b-IL-1023-57-PE40,然后将pET-20b-IL-1023-57-PE40分别转化至BL21(DE3),BL21(DE3)pLysS,Rosetta(DE3),E·coliK12TB1,ER2566中。无论是在37℃或是在26℃,亦或在培养基中添加葡萄糖的情况下,IPTG诱导后,IL-1023-57-PE40蛋白只在BL21(DE3)pLysS菌中以可溶分泌形式表达,其中以37℃时培养基中不添加葡萄糖表达量为最高,占菌体蛋白总量的15%,说明蛋白的分泌表达与菌种的选择有关。表达产物经免疫印记检测可被抗PE40的特异抗体识别。通过质粒稳定性实验证明,pET-20b-IL-1023-57-PE40在BL21(DE3)中不稳定,导致蛋白的不表达,在Rosetta(DE3)BL21,E·coliK12TB1,ER2566中稳定但不表达,因此,以Rosetta(DE3)BL21为例,通过SDS-PAGE、DNAStar和ANThewin蛋白分析软件对本室构建的几种PE重组毒素进行比较分析,我们发现:并不是所有PE重组毒素融合信号肽序列后,就能分泌表达,PE重组毒素分泌表达还可能与导向部分的性质有关。     

Sumo分子伴侣与富含二硫键的抗真菌肽Drs基因的融合有助于其可溶性表达

利用PCR引物延伸的方法合成了分子伴侣Sumo和抗真菌肽Drosomycin的融合基因,将其插入到表达载体pET-3c中,构建出重组表达质粒pET-3c-SD,并转化至大肠杆茵BL21(DE3)中。筛选重组转化子,进行表达条件的优化和表达产物的可溶性分析。结果表明在30℃条件下,用0.5mM IPTG诱导3h 后,目的蛋白表达量最高,约占菌体总蛋白的22％,其中可溶性蛋白超过了目的蛋白的80%。经过Ni-NTA纯化后,融合蛋白的纯度可达95％以上。抑菌实验表明,该融合蛋白对白僵菌（Beauveria bassiana）具有一定的抑真菌活性。本研究证实了使用分子伴侣Sumo融合表达对具有多个二硫键的小分子多肽的表达是非常有效的。     

重组人肠激酶轻链的原核表达、纯化及活性分析

【目的】在原核表达系统中实现人肠激酶轻链(Human enterokinase light chain,hEKL)的表达和纯化。【方法】通过PCR扩增得到编码hEKL的基因片段,利用基因重组技术构建原核表达质粒pMAL-s-hEKL,在Escherichia coli中进行诱导表达,菌体经超声破碎后利用Amylose亲和柱对目标蛋白进行纯化,并利用Tricine SDS-PAGE检测酶的切割活性。【结果】目的基因能够以可溶形式表达,每升发酵液可纯化得到40 mg纯度在97%以上的MBP-hEKL蛋白,活性检测表明该酶可以对含有肠激酶识别序列的蛋白进行特异性切割,酶活力达到6.0×105U/mol。     

狂犬病病毒糖蛋白在大肠埃希菌中的表达及鉴定

目的表达狂犬病病毒糖蛋白（GP）,用于狂犬病疫苗免疫抗体评估和狂犬病病毒糖蛋白功能的研究。方法采用分析软件,分析其可能的抗原表位,利用PCR方法扩增狂犬病病毒SRV9疫苗株G蛋白抗原位点区域基因,PCR产物经EcoRI和SalI双酶切后,插入大肠埃希菌表达载体pGEX-6P-1,构建重组表达质粒pGEX-6P-1/G87a和pGEX-6P-1/G100a。将重组质粒转化大肠埃希菌BL21感受态细胞中,在IPTG诱导下表达目的蛋白,进行SDS-PAGE分析。表达蛋白进行电洗脱纯化和Western blot鉴定分析。结果成功构建了pGEX-6P-1/G87a和pGEX-6P-1/G100a表达质粒,序列分析表明,插入片段大小分别为1314 bp和1275 bp。SDS-PAGE分析结果证明,在大肠埃希菌系统中成功表达了狂犬病病毒部分糖蛋白,表达的融合蛋白含有GST标签,大小分别约为74×103和73×103。Western blot鉴定结果表明,表达产物有抗原特异性并能与狂犬病病毒抗血清反应。结论利用大肠埃希菌表达系统成功表达了狂犬病病毒部分糖蛋白,表达产物有良好的反应原性。     

人SUMO-3基因原核表达及多克隆抗体制备

构建人SUMO-3基因的原核表达载体pET41a(+)-SUMO-3,表达重组GST-SUMO-3融合蛋白,制备人SUMO-3多克隆抗体。试验结果显示,通过PCR方法从重组质粒pEYFP-SUMO-3中克隆到的SUMO-3 N端93个氨基酸的基因序列与NCBI上提供的序列一致,重组质粒pET41a(+)-SUMO-3构建成功;重组pET41a(+)-SUMO-3在E.coli.BL21 (DE3) pLysS中表达GST-SUMO-3融合蛋白,分子量为44.0 kDa,与预期分子量一致;采用亲和层析纯化融合蛋白GST-SUMO-3并免疫家兔,获得人SUMO-3抗体;Western blot 检测显示该抗体可以特异性识别SUMO-3,ELISA检测结果成阳性,抗体效价约为1: 20000。实验结果为进一步研究人SUMO-3及SUMO第二类家族的功能提供了有用工具。     

人肿瘤坏死因子α抑制肽-抗炎酸性尾巴融合蛋白的原核表达及纯化

目的:表达和纯化人肿瘤坏死因子α抑制肽-抗炎酸性尾巴融合蛋白。方法:利用PCR搭接方法及基因合成方法获得目的基因,插入带有6×His标签的原核高效可溶性表达载体pET32a中,构建重组表达质粒pET32a-T9-ac-9,将重组表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导目的基因表达;对融合蛋白进行Ni2+金属螯合柱纯化。结果:构建的重组表达质粒经PCR、内切酶鉴定及基因序列测定证实;目的蛋白在大肠杆菌中获得表达,SDS-PAGE显示相对分子质量为22.917×103;对表达产物进行了亲和层析纯化,从上清中获得了纯度较高的人肿瘤坏死因子α抑制肽-抗炎酸性尾巴融合蛋白。结论:获得了可溶性的人肿瘤坏死因子α抑制肽-抗炎酸性尾巴融合蛋白,为其生物学功能研究奠定了基础。     

PHD2基因原核表达载体的构建及其在大肠埃希菌中的表达

目的构建PHD2基因原核表达载体pET-43.1b（＋）-PHD2,实现Nus-PHD2融合蛋白在大肠埃希菌中的可溶性表达。方法用SacⅠ酶切pET-43.1b（＋）制备线性化载体,设计与线性化载体两端具有至少15个同源序列的特异性引物,以真核重组质粒pCMV6-Entry-EGLN1为模板,PCR法扩增PHD2目的基因。采用In-Fusion技术构建原核表达载体pET-43.1b（＋）-PHD2,并将其导入大肠埃希菌BL21（DE3）中诱导表达。用SDS-PAGE和Western blot分析并鉴定表达出的融合蛋白。用Ni-NTA亲和层析法纯化目的蛋白。结果成功构建了PHD2原核表达载体;SDS-PAGE结果显示融合蛋白以可溶性形式表达;Western blot鉴定表明融合蛋白可以与PHD2单克隆抗体特异性结合。结论实现了Nus-PHD2融合蛋白在大肠埃希菌中的可溶性表达,为PHD2生物学功能的研究奠定了基础。