家蚕蛹变态期丝腺组织的退化与细胞凋亡特征

利用形态学观察方法、分子生物学检测方法以及20-羟基蜕皮酮(20-hydroxyecdysone)和放线菌酮(cycloheximide)体外培养方法, 研究了家蚕Bombyx mori 蛹变态期丝腺组织的退化与细胞凋亡特征。显微镜的观察显示家蚕丝腺的逐渐退化发生在吐丝期间。DNA梯度电泳的分析表明程序性细胞死亡(programmed cell death)可能伴随发生在丝腺的退化过程中。在离体培养条件下, 用20-羟基蜕皮酮处理5龄第6天幼虫的丝腺, 导致的细胞凋亡提前于对照, 提示在进入蛹变态期前, 20-羟基蜕皮酮提早激发了介导家蚕丝腺细胞凋亡与水解机制的遗传调控级联系统。上述结果表明, 20-羟基蜕皮酮能够诱导家蚕丝腺组织在蛹变态期发生程序性细胞死亡。     

昆虫变态发育过程中的细胞自噬和凋亡

在昆虫变态期,幼虫组织发生退化或消亡,原因在于蜕皮甾醇激素（ecdysteroid）,即通常所说的蜕皮激素,诱导这些组织的细胞发生了自噬(autophagy)和凋亡(apoptosis)的程序性细胞死亡(programmed cell death,PCD)。一般情况下,自噬途径构成一种饥饿应激适应性以避免细胞的死亡,表现为低水平Cvt泡(Cvt vesicle)和自噬体(autophagosome)对部分胞质溶胶、蛋白聚集体和细胞器的吞噬和降解。昆虫进入变态发育时,由于蜕皮激素的激活,由遗传级联系统调控的PCD机制被启动,低水平的常态自噬转入高水平的自噬并同时诱发凋亡,细胞进入不可逆的死亡,导致幼虫组织在变态期退化或消亡。对果蝇Drosophila变态期PCD机制中最重要的发现是:（1）在自噬发生的PI3KⅠ- Tor 和 PI3KⅢ的分子通路中,由自噬相关蛋白Atg1引发的高水平自噬能够诱导凋亡;（2）蜕皮激素诱导表达的βFTZ-F1,E93,BR-C,E74A等转录因子不但激活凋亡的Caspases通路,还能诱导自噬的发生。     

黑腹果蝇抗真菌肽基因Drs和Drs-lC 的原核可溶性表达及抗真菌活性测定

Drosomycin （Drs）是第1个从黑腹果蝇Drosophila melanogaster体内鉴定发现的昆 虫抗真菌肽因子。它对细菌无明显的抗性,但对丝状真菌具有高效广谱的抑杀作用。此外, 在黑腹果蝇基因组还存在着Drs的另外6个同系物的基因序列,其中同系物Drosomycin-lC（Drs-lC）的抗真菌谱仅次于Drs。将Drs抗真菌肽基因(Drs)和同系物Drs-lC基因（Drs-lC）进行可溶性表达,对果蔬等农产品防腐保鲜的研究有应用前景。本实验将Drs和Drs-lC分别克隆到硫氧还蛋白（Trx）融合表达载体pThiohis A中,转化宿主菌TOP10,进行可溶性表达,并从诱导表达的菌液起始浓度、IPTG的诱导浓度及诱导时间等方面进行了表达条件的优化。结果表明2种融合蛋白Trx-Drs和Trx-Drs-lC大部分以可溶形式表达,可溶性表达的Trx-Drs在上清液中约占菌体总蛋白的22％。2种融合蛋白的表达产物经 Ni-NTA亲和层析得到纯化。生测结果表明, 2种融合蛋白分别对8种供试真菌中的5种真菌显示明显的抗性。     

黑腹果蝇抗真菌肽Drosomycin同系物的免疫原性和抗真菌活性

通过黑腹果蝇 Drosophila melanogaster抗真菌肽Drosomycin（Drs）及其同系物Drs-lC和Drs-lE的抗体制备及Western blotting 结果,分析了Drs同系物的免疫原性与其抗真菌活性的关系。研究采用了2种技术路线,分别将Drs、Drs-lC和Drs-lE 基因构建成与细胞生长因子基因 afgf 融合的重组表达质粒 pET-afgf-Drs、pET-afgf-C和pET-afgf-E,以及通过基因同向串连获得重组表达质粒 pRSET-2Drs、4Drs、6Drs 和 pRSET-2E、4E、6E,并将这些重组表达质粒转化到BL21（DE3）plysS受体菌进行诱导表达。分离纯化后的融合蛋白afgf-Drs、afgf-C和afgf-E 以及串连蛋白 4 Drs、4 Drs-lE分别免疫小白鼠获得相应的抗血清。Western blotting免疫原性检测结果表明,Drs及其同系物与各自的抗血清具有强的免疫反应,同时相互间也有交叉免疫反应,提示它们具有相似的主要抗原决定簇,这些抗原决定簇可能与抗真菌活性无关。同系物之间抗真菌活性的差异可能来源于某些细微结构上的差异。     

昆虫细胞自噬的生物学意义和自噬体膜的来源

细胞自噬(autophagy)是生物体广泛存在的细胞内自主降解过程。该过程通过自我吞噬细胞质成分和细胞器形成具有双层膜结构的自噬体, 与溶酶体融合实现细胞内物质的循环利用。细胞自噬在饥饿、 缺氧、 内质网胁迫、 病原入侵、 蛋白聚集等不良环境条件下实现自我挽救, 而细胞自噬的大量发生也是程序性细胞死亡(PCD)的启动和执行者之一。目前人们对自噬体分子组装和自噬发生的分子通路已有较深入的了解, 但仍然在很多重要问题上难以达成共识。本文结合我们的研究进展, 对昆虫细胞自噬的生物学意义和自噬体膜的来源问题进行综述和探讨。昆虫在营养相对匮乏的情况下发生低水平自噬(常态自噬), 用于维持细胞内的新陈代谢和继续生存的需要。昆虫在摄食阶段受到过度饥饿的刺激, 在变态发育时期受到蜕皮激素(20E)的诱导, 幼虫组织细胞发生高水平自噬和凋亡(apoptosis), 细胞表现为不可逆死亡, 过度饥饿导致幼虫发育迟缓或者死亡, 而20E导致幼虫蜕皮和幼虫组织退化或消亡。不同于酵母和高等动物细胞中的深入研究, 病原入侵是否和如何诱导昆虫细胞发生自噬, 目前尚缺乏足够的文献依据, 值得深入探讨。几乎所有的细胞器(内质网、 高尔基体、 线粒体)膜都可能是自噬体膜的来源, 这一问题在昆虫中也有待进一步诠释。     

Sumo分子伴侣与富含二硫键的抗真菌肽Drs基因的融合有助于其可溶性表达

利用PCR引物延伸的方法合成了分子伴侣Sumo和抗真菌肽Drosomycin的融合基因,将其插入到表达载体pET-3c中,构建出重组表达质粒pET-3c-SD,并转化至大肠杆茵BL21(DE3)中。筛选重组转化子,进行表达条件的优化和表达产物的可溶性分析。结果表明在30℃条件下,用0.5mM IPTG诱导3h 后,目的蛋白表达量最高,约占菌体总蛋白的22％,其中可溶性蛋白超过了目的蛋白的80%。经过Ni-NTA纯化后,融合蛋白的纯度可达95％以上。抑菌实验表明,该融合蛋白对白僵菌（Beauveria bassiana）具有一定的抑真菌活性。本研究证实了使用分子伴侣Sumo融合表达对具有多个二硫键的小分子多肽的表达是非常有效的。     

RNA干扰对家蚕丝腺蜕皮激素相关基因表达的影响

昆虫变态发育过程中,蜕皮激素通过一系列的激素相关转录因子进行信号的转导和放大,从而完成对生长变态发育的调控,其中蜕皮激素受体(EcR)及转录因子BR-C和E74A可能作为早期因子发挥作用.为了研究这3个早期转录因子在鳞翅目昆虫中的功能,本研究采用体外合成dsRNA的方法,将合成的dsRNA分别注射熟蚕期的家蚕Bomby...     

果蝇抗微生物肽基因的免疫诱导模式

果蝇作为一种模式昆虫,为研究昆虫和人类的先天免疫发挥了重要作用。目前对果蝇体内免疫诱导产生的抗微生物肽多基因家族在分子进化、抗菌功能的分子特征和免疫诱导表达的信号传递机制等方面的研究进展,进一步加深了人们对昆虫乃至其他动物和人类先天免疫模式的认识,为研究其他昆虫特别是作为主要农林害虫的鳞翅目昆虫的先天免疫机制发挥了重要作用。本文集中对黑腹果蝇Drosophila melanogaster抗微生物肽及其免疫模式的研究结果和最新进展进行了介绍,其中包括作者近几年的研究结果。     

果蝇蜕皮激素诱导程序性细胞死亡的遗传调控因子

近年来关于果蝇程序性细胞死亡（programmed cell death, PCD）的研究结果表明,在果蝇的变态发育过程中,蜕皮激素与受体结合后诱导转录因子的表达。这些转录因子作为程序性细胞死亡调控网络中的初、次级应答信号,激活凋亡诱导因子Reaper、Hid和Grim的表达。Reaper、Hid和Grim进而阻止凋亡蛋白抑制因子的活性,从而启动半胱氨酸蛋白酶caspase途径,引起细胞凋亡（apoptosis）。该文综述了蜕皮激素诱导的果蝇程序性细胞死亡中各遗传调控因子之间的关系。     

昆虫抗菌肽和抗真菌肽结构与功能的关系及分子设计

在对GenBank和EMBL数据库中登录的昆虫抗微生物肽 (antimicrobial peptide, AMP), 即昆虫抗菌肽 (antibacterial peptide) 和抗真菌肽 (antifungal peptide, AFP) 进行归类整理的基础上,对天蚕素族(cecropins )抗菌肽结构与功能的关系及人工改造的分子设计策略,特别是对目前新发现的一些昆虫抗真菌肽的已知结构与功能关系的研究进展、存在问题等进行了简要介绍和分析,为从事昆虫抗微生物肽的理论研究和发展新型抗生素药物提供了必要的信息。