一种简便高效的改良降落PCR

降落(touchdown,TD)PCR通常涉及15个退火温度,程序设计复杂。报道了一种简便高效的改良降落PCR,只需5个降落退火温度,以杜氏盐藻(Dunaliellabardawil)基因组为模板,设计一对引物扩增胡萝卜素生物合成相关(carotenebiosynthesisrelated,cbr)基因的第3外显子。实验证实该方法程序简单,比标准降落PCR步骤简化70%,且产物的特异性及效率都有较大提高。     

PCR技术研究进展

PCR(Polymerasechainreaction)在生命科学研究及相关诸多领域已经得到了广泛应用。本文对PCR技术的最新进展作一简要综述,包括:热循环仪的改进,引物的软件设计及网络设计,各种DNA聚合酶体系及其特性,多种PCR(MultiplexPCR),DNAshuffling,PCR芯片,固相PCR和电子PCR(ElectronicPCR)的原理和应用 。     

变性梯度凝胶电泳技术在微生物多样性研究中的应用

变性梯度凝胶电泳是不依赖于培养的、依据DNA分子的大小和所带电荷分析微生物多样性和动态变化的分子生物学技术,具有检测极限低、分析速度快及重复性好等优点。主要对变性梯度凝胶电泳原理、特点及其在微生物多样性应用方面进行综述。     

应用于染色体步移的PCR扩增技术的研究进展

各种建立在PCR基础上染色体步移的方法能够根据已知的基因序列得到侧翼的基因序列。染色体步移技术主要应用于克隆启动子、步查获得新物种中基因的非保守区域、鉴定T-DNA或转座子的插入位点、染色体测序工作中的空隙填补,从而获得完整的基因组序列等方面。其方法主要有3种：反向PCR的方法,连接法介导的PCR的方法以及特异引物PCR的方法。文章就各种方法进行举例说明并加以分析比较。     

Evaluation of PCR-based methods for isolating flanking regions of genes

Several polymerase chain reaction (PCR)-based methods are available for isolation of unknown genomic fragments. In the present study, a comparative evaluation of a few methods of ligation-mediated PCR methods and a ligation-independent one were made by isolating promoter fragment for N-methyltransferase gene involved in the caffeine biosynthetic pathway of Coffea canephora. The benefits of tertiary PCR and the effects of a 4-base cutting restriction endonuclease on the size of the PCR products obtained were demonstrated in one of the ligation-mediated PCR methods. The methods adopted in this study differed in the sizes of the 5'-flanking regions obtained. The efficiencies of various methods used reflect the inherent limitations of the PCR-based methods for isolation of unknown flanking regions.     

梅毒分子生物学实验诊断方法的研究进展

梅毒的临床表现十分复杂,诊断主要依靠实验室检测方法。传统的梅毒实验室诊断方法暴露出诸多缺点,本文综述了国外一些分子生物学技术用于梅毒实验室诊断的方法(以基因工程重组抗原的血清学方法和聚合酶链反应)的研究进展。     

通用型转铁蛋白融合表达载体的构建及应用价值

构建通用型转铁蛋白融合表达载体,利用PCR方法扩增编码人转铁蛋白N端半分子的基因片段,通过酶切、连接、转化等分子克隆方法构建通用型转铁蛋白融合表达载体。PCR扩增了一个长约1.1 kb的包含ScaI酶切位点的基因片段,插入pPICZα的PmlI和XbaI酶切位点,转化后进行菌液PCR鉴定,成功获得重组子pPICZα-TfN,测序结果表明载体构建成功,重组质粒pPICZα-TfN能被ScaI酶切。本研究成功构建通用型转铁蛋白融合表达载体,构建的载体可以用于转铁蛋白融合表达载体的构建。     

GFP基因转化藿香的研究

以藿香无菌苗幼嫩茎段为受体,利用根癌农杆菌介导法进行了绿色荧光蛋白基因(GFP)的遗传转化研究。经农杆菌侵染,通过共培养、选择培养后获得其抗性愈伤组织,对抗性愈伤组织的诱导过程进行了GFP荧光检测。结果表明,GFP基因能在抗性愈伤组织中强烈表达,证明GFP基因能够在藿香遗传转化中得到应用。对抗性愈伤组织的PCR检测初步证实外源GFP基因已整合到藿香愈伤组织的基因组中。     

蜂蜜中转基因成分的PCR检测

我国是蜂蜜生产大国,棉花是主要蜜源植物之一。近些年来,我国种植的棉花大多为转基因抗虫棉,棉花蜜中是否含有转基因成分,引起国内外广大消费者的密切关注。本文以抗虫棉种植地采取的棉花蜜为原料,采用改良CTAB法,在DNA提取过程中,用PBS缓冲液除去其中大部分的可溶性多糖,并提高CTAB提取缓冲液中NaCl浓度以去除残余多糖,从蜂蜜中成功提取出片段完整、纯度较高的DNA,DNA得率为486ng/mL,OD260/OD280为2.01,能够满足后续PCR定性检测的需求。从以转基因棉花为蜜源的蜂蜜中检测出外源DNA片段,建立了蜂蜜中转基因成分的PCR检测技术。本研究对转基因食品标识制度的完善、转基因食品监管、减少贸易摩擦以及保证消费者权益等具有重要意义。     

乙二醇和1，2-丙二醇增强富含GC碱基人类基因组DNA模板的PCR扩增

基因（组）操作者常会遇到高GC序列难于扩增的问题。全球范围内也还没有很成熟的通用方法来解决这个问题。经过系统的摸索,发现选用有机试剂乙二醇和1,2-丙二醇能得到比较满意的特异的PCR产物。104段随机选取的GC含量在60%~80%之间的人类基因组序列（长度在700~800bp）基本上全部得到较好的扩增。     

PCR结合反向斑点杂交法检测侵袭性曲霉感染的初步实验研究

目的评价PCR结合反向斑点杂交法检测动物模型和临床免疫抑制患者的侵袭性曲霉感染的可行性。方法建立侵袭性曲霉感染动物模型,收集动物血清和健康人群、免疫抑制患者的血清,进行PCR-种特异性探针检测。以1对真菌特有的28S rRNA保守序列结构作为真菌通用引物,以临床常见的4个曲霉菌种,即烟曲霉、黄曲霉、黑曲霉、土曲霉的种特异性序列为种特异性探针,与扩增产物进行反向斑点杂交。结果PCR-探针杂交检测动物接种后24h时阳性血清为16/24,48h为18/24,72h为19/24,96h为24/24。阳性率为80%,特异性为95.8%。同时取血行真菌培养,烟曲霉阳性率仅为5%。临床标本显示两例确诊IA患者血清均为阳性,且能鉴定菌种。健康对照人群标本检测显,阴性38例,假阳性2例。结论PCR-探针杂交法较传统血培养法能更快速、灵敏地检测动物模型的侵袭性曲霉感染,并可用于对IA高危患者的监测。     

高中生物学选修模块1中DNA相关实验的整合

高中生物学课程标准选修模块1涉及3个与DNA相关的实验：DNA的粗提取及鉴定,PCR和DNA电泳,其中后2个实验开展的难度较大,除硬件因素外,实验条件的摸索和材料准备也是难以解决的问题,本研究力求将3个实验有机结合,摸索了实验条件,在一定程度上解决了实验材料的问题,同时探究了3个实验之间的内在联系,为这一部分的教学提出了建议。     

C57BL/6小鼠幽门螺杆菌感染动物模型的建立

目的：建立幽门螺杆菌（Helicobacter pylori,Hp）小鼠感染模型。方法：建立Hp经口感染SPF级小鼠的动物模型,取小鼠胃粘膜组织,利用PCR技术、尿素酶实验、细菌培养等方法检测接种小鼠,对结果进行判定。结果：Hp可感染C57BL／6小鼠并在小鼠胃部定植。     

高等植物启动子克隆方法的研究进展

启动子是植物基因工程中一个重要的研究对象,文章简述了启动子的定义、分类和启动子的研究策略,从组成型启动子、组织特异型启动子和诱导型启动子3个方面介绍了它们的功能和结构的研究现状。启动子的克隆对于构建基因工程载体,表达目的蛋白有着重要的意义。着重介绍了启动子克隆的方法,从常用的利用启动子探针型载体筛选启动子到PCR方法的应用,及此后相继出现的一些基于PCR法的克隆启动子技术,像I-PCR,P-PCR,SSP-PCR,YADE,TAIL-PCR等,为克隆启动子提供了更可靠,更合理的方法。     

几种芽胞杆菌溶血素BL基因及其溶血素的检测

用PCR方法对几种芽胞杆菌溶血素BL基因进行了检测,结果表明7株蜡样芽胞杆菌含有溶血素BL基因hblA、hblC、hblD,其他枯草芽胞杆菌、多粘类芽胞杆菌、地衣芽胞杆菌检测到部分溶血素基因;通过血平板培养的方法检测结果表明只有含有溶血素全部基因的菌株才会产生溶血环,从而为筛选不产生溶血素的有益芽胞杆菌奠定一定基础。     

PCR和随机引物标记探针的方法比较

采用PCR标记法和随机引物标记法对小白鼠、欧洲田鼠(M icrotus arvalis和Pitymys duodecim costatus)的Sry基因保守区进行地高辛标记,结果显示PCR标记的探针灵敏度要高于随机引物法,同时对两种标记方法进行了比较,为进一步进行Southern杂交研究打下了基础。     

利用Pyrobest DNA聚合酶一步法进行大片段基因的定点突变

目的:介绍一种简单、快速、高效和经济的进行大片段基因定点突变的方法。方法:小量抽提含有NM23H1-EGFP融合基因的逆转录病毒真核表达质粒pLXSN-NM23H1-EGFP,体外合成突变引物对,利用高保真Pyrobest DNA聚合酶对质粒DNA进行PCR突变反应,然后用DpnⅠ限制性内切酶消化PCR产物以去除模板DNA,取适量消化产物转化大肠杆菌XL1-Blue,随机挑选克隆进行测序筛选、鉴定所需突变株。结果:在NM23H1-EGFP基因中引入了S44A、P96S、H118F、S120G、P96S-S120G等5个替换突变位点及9bp处的插入突变。结论:该方法简单、快速、高效、经济,不须纯化中间产物,不须亚克隆,突变效率几乎为100%,是一种值得推广应用的方法。     

深圳地区产超广谱β-内酰胺酶菌株的TEM基因分析

目的了解本地区临床分离的产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)株携带TEM基因的情况.方法应用表型确证试验筛选产ESBLs大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌.碱裂解法提取产酶株的质粒,应用PCR方法分析TEM基因.结果215株产ESBLs菌株中TEM基因阳性87株,阳性率为40.5%,其中产酶大肠埃希菌TEM阳性率为49.7%,肺炎克雷伯菌阳性率为18.8%.TEM型产酶株主要来源于痰和尿标本(37.9%和22.0%),在肝胆外科、重症监护室和老年病科分布较多.结论TEM型为本地区产ESBLs大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌常见的基因型,广泛分布于各临床科室,需引起重视.     

16S rRNA/DNA-PCR对初生新生儿肠道乳酸杆菌和大肠埃希菌的动态检测

目的观察新生儿生后肠道菌群的动态变化。方法采用16S rRNA/DNA荧光定量PCR技术,分别对40例足月儿和40例早产儿生后第1（〉12h）、4、7天粪便标本中的乳酸杆菌和大肠埃希菌进行定量分析。结果不同日龄足月儿粪便标本中乳酸杆菌数量的对数值分别为5.50±0.81、6.87±0.81、9.20±0.87,早产儿分别为4.89±0.46、6.05±0.46、8.06±0.18;不同日龄足月儿粪便标本中大肠埃希菌数量的对数值分别为6.49±0.40、7.59±0.58、7.15±0.55,早产儿分别为6.32±0.51、7.39±0.78、7.05±0.63;2种细菌对数值分别在组间行单因素方差分析,差异有显著性（P〈0.05）;组内行配对t检验,差异也有显著性（P〈0.05）。结论新生儿肠道菌群的建立是动态变化的,个体间差异受多因素影响,早产儿落后于足月儿。