人类HLA抗原之轻链—β_2微球蛋白的分离、提纯和鉴定

β_2微球蛋白(β_2m)是分子量为12000的小分子球蛋白,电泳中位于β_2区。β_2m在细胞膜上以非共价键的形式和一个表现为HLA 抗原的特异性大分子糖肽相连。肾移植病人在排异期的尿中β_2m 含量较高,是提取β_2m 很好的材料。本文报道了利用SephadexG-100凝胶过滤、DEAE-32离子交换梯度层析等方法从这类尿样中纯化了β_2m。对纯化的样品进行鉴定,发现在醋酸纤维素薄膜电泳中,在SDS-PAGE 及无SDS 的PAGE 中都呈现一条色带,示成分单一。分子量测定为12,000,电泳移动在β_2区,最大和最小的紫外吸收分别为277nm 和250nm,免疫双扩散和免疫电泳揭示纯化样品不是IgG,lgA 和转铁蛋白,鉴定结果表示:所纯化之样品之物化性质和文献报道的标准β_2m 相同。     

甲_2巨球蛋白的丙烯酰胺梯度SDS凝胶板电泳分析

甲_2巨球蛋白(简称α_2M)是一种分子量为725000的大分子糖蛋白。天然有活性的和失活的α_2M经SDS热引导和巯基乙醇还原分解的亚基分子量有明显差别。不同来源的α_2M亚基分子量也略有差异。本实验用3-25％丙烯酰胺梯度SDS凝胶板电泳来鉴定纯化的猪α_2M、大鼠α_2M和人α_2M制剂。结果指出猪α_2M和人α_2M均有185000、125000和62000三条亚带,代表有活性的天然α_2M,大鼠α_2M电泳图谱指出,130000分子量亚带代表天然α_2M,29000和90000分子量二带为失活部分。人α_2m制剂图谱表明除了混有两种球蛋白外,只有一条62000分子量亚带代表少量有活性的α_2M。     

β_2微球蛋白的微量测定和应用

β_2微球蛋白(简称β_2mG)分子量小,因电泳显于β_2区带而得名,广泛存在于人各种体液中,是免疫球蛋白和移植抗原的一个组成成分,在生物学、免疫学和医学中已日益受到重视。本室建立血清β_2mG 放射免疫分析法(RIA),方法简便、特异性、灵敏度和重复性符合要求,对研究β_2mG的生理代谢及临床上诊断肾脏、肝脏及血液系统疾病是一种有用的辅助指标。一、材料和方法 1.人β_2mG 的提纯肾移植急、慢性排异期患者尿液,经硫酸铵粗提和凝胶 G100 层析、DE52 离子交换层析,收集洗脱液,     

青稞中β-1,3葡聚糖酶的纯化及部分性质研究

β-1,3-葡聚糖酶[EC．3．2．1．39]存在于大多数的高等植物中,它们由一个小的基因家族编码,在植物不同的生理活动中起着重要的作用。采用NaCl抽提、硫酸铵分部沉淀和2步离子交换法和分子筛从青稞的胚芽中提纯得到了一种β-1,3-葡聚糖酶。在非变性电泳中纯化的β-1,3-葡聚糖酶用银染只有一条蛋白带,运用底物进行的活性染色时在相同位置也只显示一条酶活性带。此活性染色可以直接在电泳胶板上快速鉴定和检验β-1,3-葡聚糖酶。纯化的β-1,3-葡聚糖酶在还原及非还原条件下的SDS-PAGE变性电泳中,呈现一条分子量为32kD的主要蛋白带及2条低分子量的弱带,表明此酶无链内二硫键存在。等电聚焦分析显示其等电点为8．1。上述结果表明纯化得到的是一种碱性β-1,3-葡聚糖酶。     

萱草花粉中微管蛋白生物化学性质

微管（microtubule）是细胞骨架的重要成份,参与囊泡运输、信息传递等多种生命活动。我们从萱草花粉中纯化了植物微管蛋白,对其生物化学及生物物理学部分性质研究表明,纯化的微管蛋白经超离心法测定沉降系数为6．2S,SDS-PAGE分析α,β微管蛋白分子量为56kD、58kD,凝胶扫描分析纯度为93．7％。等电聚焦电泳测定等电点为pI=5．35。光谱学性质研究结果表明,最大紫外吸收峰为280．8nm,荧光光谱研究表明最大激发波长为282nm;此时的最大发射峰为338nm,圆二色光谱分析二级结构表明小螺旋占27．24％,β-折叠占24．48％,无规卷曲为48．28％,呈典型球蛋白特征。     

人β2-微球蛋白基因克隆及其在大肠杆菌中的高效表达

β2-微球蛋白(β2m)是主要组织相容性复合体(MHC)Ⅰ类分子的轻链部分,为制备MHCⅠ类分子四聚体的必要成分。根据已报道的序列设计特异引物,利用RT-PCR方法从人白细胞中克隆了β2m基因,并构建了成熟β2m的原核表达载体,在大肠杆菌中得到高效表达。表达的β2m大部分在包涵体中,经洗涤、变性和复性,并以强阴离子交换柱层析纯化,获得SDS-PAGE纯的人重组β2m,Western印迹法分析表明该蛋白具有与抗人天然β2m抗体反应的特性。此工作为制备MHCⅠ类分子四聚体奠定基础。     

免疫球蛋白

免疫球蛋白(immunoglobulins),是对含有抗体的三种球蛋白(γ-,β_(2A)-及β_(2M)-球蛋白)的概括语。自1937年Tiselius 提出在电泳上移动最慢的γ-球蛋白就是抗体蛋白以来,人们一直把γ-球蛋白与抗体等同起来看待。近年来由于超速离心法、层析法、凝胶扩散法、免疫电泳法等新技术的使用,发现与免疫有关的蛋白质的理化学性质及免疫学特性颇不均一(Heterogeneity)。例如,在超速离心上有7S与19S之别,在免疫电泳上亦不仅限于电泳图的末端部位,而是通过β-球蛋白一直扩展到α_2-球蛋白区域(图1)。所以正确地     

一种具有抑制糜蛋白酶活性的血清DNA结合蛋白质的纯化和理化特性

 本文采用离子交换层析,DNA亲和层析和硫酸铵盐析三步从人血清中分离纯化了一种肿瘤相关DNA结合蛋白质(64DP)。本方法较简便,产率提高。经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳和免疫电泳鉴定纯度符合要求。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定分子量为64,000。等电聚焦电泳测得等电点在4.2左右。醋酸纤维膜电泳和转移电泳表明其为一种α_1球蛋白。过碘酸西夫氏糖蛋白染色呈阳性反应。氨基酸分析和酶抑制试验证实64DP与α_1抗縻蛋白酶很相似。     

鸭血超氧化物歧化酶(SOD)的纯化及性质研究

超氧化物歧化酶(E、C、1.15.1.1)是催化超氧阴离子起歧化反应的金属酶类,血红细胞中的SOD属Cu Zn—SOD。本文详细报道了从鸭血分离纯化SOD的改进方法(同时用猪血作对比研究)。设计了热变性、(NH_4)_2SO_4分级监析、低浓乙醇—氯仿短时去除残留血红蛋白、凝胶层析四步纯化方案,获得高产率电泳纯SOD。用紫外扫描,PAGE电泳后考马斯亮蓝和SOD活性杂色,SDS—电泳,HPLC分离和各电泳带组分的N—端测定等技术检测纯度,并进行性质研究。证明所得SOD是均一的;N—端为Ala;分子量和亚分子量各为32,359和16,500dt;并与猪血SOD对比研究其某些性质;对HPLC出现的多个活力峰及PAGE电泳显现的多条活性带进行了讨论。     

团头鲂卵壳蛋白的分离与纯化

报道了一种从团头鲂卵壳中提取卵壳蛋白的有效方法。该提取淮经SDS－PAGE电泳鉴定后,证明有三条主要的蛋白带,其分子量分别为64KDa,56KDa和52KDa,借助于制备型SDS－PAGE电泳和电洗脱分离纯化技术,获得了三种高纯度的印壳蛋白。     

黑皮扁豆凝集素提纯及部分性质研究

采用NaCl抽提、硫酸铵分部沉淀和2步离子交换法从黑皮扁豆中纯化得到一种甘露糖专一凝集素(DPL)。在非变性电泳中纯化的DPL只有一条蛋白带,在还原及非还原条件下的SDS-PAGE中呈现两条蛋白带,其分子量分别为36．8kD和39．8kD;利用FPLC经Sephacryl S-300凝胶过滤测得其表观分子量为155kD,表明DPL由2个α亚基和2个β亚基组成,无二硫键。DPL的等电点为pH6．18,含1．6％糖,为酸性糖蛋白。DPL的热稳定性和pH稳定性,与已报道的甘露糖/葡萄糖专一的豆科凝集素相似。     

人β2-微球蛋白基因克隆及其在大肠杆菌中的高效表达

β₂-微球蛋白(β₂m)是主要组织相容性复合体(MHC)Ⅰ类分子的轻链部分, 为制备MHC-Ⅰ类分子四聚体的必要成分。 根据已报道的序列设计特异引物, 利用RT-PCR方法从人白细胞中克隆了β₂m基因, 并构建了成熟β₂m的原核表达载体, 在大肠杆菌中得到高效表达。 表达的β₂m大部分在包涵体中,经洗涤、变性和复性,并以强阴离子交换柱层析纯化,获得SDS-PAGE纯的人重组β₂m,Western印迹法分析表明该蛋白具有与抗人天然β₂m抗体反应的特性。此工作为制备MHC-Ⅰ类分子四聚体奠定基础。     

次级淋巴组织趋化因子（SLC）基因克隆及在大肠杆菌中的表达

次级淋巴组织趋化因子(SLC)是通过搜索表达序列标签(EST)数据库克隆出来的一CC类趋化因子。以人SLC序列为蓝本,利用重叠PCR(SOE-PCR)的方法获得了适宜在大肠杆菌中表达的SLC基因,将此序列分别克隆至表达载体pTMF和pALM中,转化大肠杆菌,诱导表达。Western Blotting鉴定结果表明目的蛋白以可溶蛋白和包涵体两种形式表达,两种形式的蛋白所占比例依培养和诱导条件的不同而变化。对两种形式的表达产物分别用Ni-NTA金属亲和层析和包涵体复性方法纯化在实验中还对纯化条件进行了探索。对纯化蛋白的电泳结果显示:纯化样品的分子量比预期的分子量要大。     

鸦肝超氧化物歧化酶的纯化

本文用低浓度氯化钠与肝脏一起匀浆,75℃加热,硫酸铵分级沉淀,在Cu~(2+)存在下透析,sephadex G-75柱层析等方法,从寒鸦肝脏中纯化出铜锌超氧化物歧化酶。对其理化性质鉴定表明,用此法纯化的SOD为均一性纯酶,比活性为4734U/mg pr,分子量32.6kD,紫外吸收峰在258.6nm。理化性质与文献报道的不同来源的同类酶基本相同。     

巨大芽孢杆菌β-淀粉酶基因的克隆、表达和酶学性质分析

从巨大芽孢杆(Bacillus megaterium)的全基因组DNA文库中筛选出一个β-淀粉酶基因amyG,分析测定了其核苷酸序列并进行了诱导表达;其中amyG编码的蛋白有545个氨基酸、分子量为60.194 kD,与已报道的巨大芽孢杆菌DSM319的β-淀粉酶序列有着94.5%的同源性.经氨基酸序列比较分析发现,AmyG从N末端到C末端依次由信号肽域、糖基水解酶催化功能域和淀粉结合域3个功能域组成.其中催化功能域里含有第14家族糖基水解酶常见的几个高度保守的酶催化活性区.经多步纯化,重组酶的比活共提高了7.4倍,获得凝胶电泳均一的蛋白样品;经SDS-PAGE电泳测定,酶AmyG的分子量为57 kD.该酶的最适反应温度为60℃,最适反应pH为7.0;在温度不超过60℃时,酶活较稳定:AmyG能迅速降解淀粉生成麦芽糖,属于外切β-糖苷酶.     

金环蛇(Bungarus fasciatus Schneider)蛇毒的研究——Ⅰ.金环蛇蛇毒毒性组分的分离纯化与鉴定

金环蛇毒经羧甲基-葡聚糖凝胶C-50柱层析分离为几个主峰,其中Ⅷ、Ⅹ、ⅩⅢ、ⅩⅣ、ⅩⅤ及ⅩⅥ六个峰为主要致死成分。在大白鼠膈神经-膈肌及其他神经肌肉标本上用电生理方法检测蛋白含量较高的Ⅹ_2、ⅩⅢ_2、ⅩⅣ_2及ⅩⅥ_1峰的作用,观察它们对微终板电位、终板电位及肌膜电位的影响。此外,还检测它们的离体去神经肌肉标本对乙酰胆碱敏感性的影响。实验结果提示,ⅩⅣ_2峰及ⅩⅥ_1峰中含有作用于突触后的神经毒性组分,ⅩⅢ_2峰中含有细胞毒性组分,X_2峰中含有细胞毒性及突触前神经毒性作用组分。再经Bio Rex-70柱层析后,从ⅩⅢ_2峰中纯化得一个细胞毒素,从ⅩⅣ_2峰中纯化得一个突触后神经毒素,它们在8M 尿素聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳中呈单一区带。凝胶过滤法测得该细胞毒索的分子量为13200、神经毒素的分子量为7,900。细胞毒素的小白鼠静脉注射最小致死量为4.1微克/克,神经毒素为0.16微克/克。     

竹叶青(Trimeresurus stejnegeri)蛇毒凝血酶样酶的分离纯化及其理化性质的研究

用CM—Sephadex C—25分离竹叶青粗毒,再经DEAE—Sephadex A—50和CM—Sephadex C—25纯化得到凝血酶样酶组分Ⅰ。用DEAE—Sephadex A—50分离竹叶青粗毒,再经DEAE—Sepharose CL—6B纯化得到凝血酶样酶组分Ⅱ。用聚丙烯酰胺凝胶电泳和SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定,组分Ⅰ在两种电泳中均为一条带; 组分Ⅱ在两朴电泳中均为二条带,经切割后鉴定证明组分Ⅱ的二条带都是凝血酶样酶。组分Ⅰ的分子量为54,500,由261个氨基酸残基组成,其中Asp和Glu含量较高,含14％中性己糖,13.1％己糖胺和14.7％唾液酸,等电点为3.5,在280nm处的消光系数为E_(1cm)~(0.1％)=0.855。组分Ⅱ的分子量分别为54,000和47,000。经凝胶电泳分离后用过碘酸—Schiff's试剂染色,证明组分Ⅰ和组分Ⅱ都是糖蛋白。     

金属螯合亲和层析法纯化猪红细胞超氧化物歧化酶

本文报道以Sephadex G-200为基质的金属螯合亲和层析法纯化SOD、其比活为4508U/mg蛋白,收率为90.4％,经酸、碱、SDS-PAGE、考马斯亮兰染色均呈一条带,特异性的SOD活性染色呈阳性。分子量为34,000,氨基酸组成测定表明Tyr含量少,Gly含量高,紫外吸收光谱最大吸收在258nm处,园二色谱结果表明SOD空间结构为β—折迭及无规态,含极少量或几乎不含α—螺旋,等电聚焦电泳测定SOD有微不均一性,等电点分别为5.25,5.35和5.65。     

Beta proteobacterium sp.T1菌株产壳聚糖酶的分离纯化

目的:分离纯化Beta proteobacterium sp.T1菌株所产的壳聚糖酶.方法:采用(NH4)2SO4(20%～70%)分级盐析、阴离子交换树脂DEAE Cellulose 52柱层析、SephadexG-100柱层析技术进行分离纯化,采用SDS-PAGE鉴定酶的纯度、分子量.结果:经DEAE Cellulose 52柱层析,壳聚糖酶纯化了13.19倍;经Sephadex G-100柱层析,壳聚糖酶纯化了26.32倍.结论:纯化后的酶经SDS-PAGE鉴定已达到电泳纯,分子量29.5kDa.     

固定pH梯度等电聚焦法分离纯化人胸腺活性肽

 本文用4—7月龄胎儿胸腺,按照匀浆—80℃加热—丙酮沉淀—抽提—超滤等一系列步骤制备人胸腺混合肽。用固定pH梯度聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦技术,结合紫外薄层扫描法定位,从胸腺混合肽中得到四种纯化的胸腺肽HTP α_1,β_1,β_2和γ_1;分别测得其等电点为4.6,5.3,5.8和7.6,分子量分别为4800,6700,7200—7300和12,000—13,000。另外至少还得到四种部份纯化的胸腺肽。由玫瑰花结和末端转脱氧核苷酰酶活力测定结果,证明分离得到的各种胸腺肽均有较高的生物活性。