一种简便实用的限制性核酸内切酶定量测活方法

对限制性核酸内切酶进行酶学研究,无论 在理论上或应用上都有着重要的意义。准确而 简便的定量测活方法,是进行酶学研究的前提 之一。目前这类酶的定量侧活,多采用同位素 标记法或微光密度扫描法。一”,但前者受到标记 底物来源、同位素半衰期和比强度的影响;后者 需要昂贵的仪器,故它们的使用范围受到一定限制。下面介绍我们建立的一个简便实用的方 法,即对酶切凉脂糖凝胶电泳拍照记录,其负片置测微光度计上进行测定,以此来对酶活力进 行定量。     

同位素稀释法在绝对定量蛋白质组中的研究进展

绝对定量蛋白质组是指基于蛋白质组学方法对细胞、组织或体液中的蛋白质进行绝对量或浓度测定．目前,常用的绝对定量方法主要有基于同位素稀释法的蛋白质组学绝对定量方法和基于质谱数据统计分析的非标记方法．基于同位素稀释法的绝对定量方法是用已知量的同位素标记物对与其混合的样本蛋白质浓度进行测定．常见的同位素标记物包括：由AQUA法、QconCAT法产生的特异性水解肽段,由PSAQ法、Absolute SILAC法产生的标记蛋白和由PrESTs-SILAC法产生的蛋白抗原表位标签．由于同位素稀释法可以对蛋白质进行准确和精确定量,对于临床疾病的诊断和治疗具有明显的现实意义．本文对同位素稀释法在绝对定量蛋白质组中的研究进展及其优缺点和最新应用进行了评述．     

稳定同位素化学标记结合质谱技术在定量蛋白质组学中的应用

传统的蛋白质组定量策略主要是通过双向凝胶电泳来进行相对定量。由于该方法不能对相对分子质量极高或极低、等电点极酸或极碱和含量低的蛋白质以及膜蛋白质等进行有效分离和检测,所以已不能适应目前蛋白质组研究深入发展的需要。近年来,定量蛋白质组学的发展主要是以同位素亲和标签试剂为代表的、以质谱检测为核心的稳定同位素化学标记方法。稳定同位素化学标记结合质谱技术,使定量蛋白质组的分析更趋简单、准确和快速,具有良好的发展前景。本文对稳定同位素化学标记结合质谱技术在定量蛋白质组学中的研究进展进行了评述。     

同位素标记相对和绝对定量蛋白组技术研究进展

近年来定量蛋白组学技术迅速发展,目前常用的有双向荧光差异凝胶电泳、同位素亲和标记、15N同位素标记、同位素标记相对和绝对定量和细胞培养条件下稳定同位素标记技术等。同位素标记相对和绝对定量技术以其高通量、高灵敏度、高重复性、高动态检测限和能对各种复杂样品进行相对和绝对定量研究等优势而备受研究者青睐,目前已发展到在同一实验中分析8组样品,增加了实验设计的灵活性。我们就同位素标记相对和绝对定量技术在定量蛋白组史中的地位作用、研究策略,以及在病毒致病机制研究和医药临床相关问题中的应用做简要综述。     

定量稳定性同位素探针技术及其在微生物生态学研究中的应用

定量稳定性同位素探针技术(qSIP)是将生态系统中微生物分类性状与代谢功能联系起来的有效工具,能够定量测定特定环境中单个微生物类群暴露于同位素示踪剂后微生物代谢活动或生长速率。qSIP技术采用定量PCR与高通量测序技术并结合稳定同位素探针技术(SIP),通过向环境样品添加标记底物进行培养,提取微生物生物标记物,利用超高速等密度梯度离心将被同位素标记的重链核酸与未被标记的轻链核酸进行分离,并对所有组分微生物类群进行绝对定量和测序分析,基于GC含量和未标记处理DNA密度曲线量化参与吸收转化的DNA同位素丰度。本文重点阐述qSIP的技术原理、数据分析流程及其在微生物生态学研究中的应用进展,并对该技术存在的问题进行了分析和展望。     

稳定同位素标记试剂DiART在蛋白质组中的定量特征研究

等重同位素标记方法,如同位素标记相对和绝对定量(iTRAQ),可以对肽段进行化学标记,之后通过质谱分析得到的报告离子的强度信息而实现对肽段的定量.目前,这种标记技术在定量蛋白质组学研究中有广泛应用.DiART也是一种等重同位素标记方法,且与iTRAQ的定量原理类似,但是其化学结构组成与iTRAQ有所不同,因而其定量特征有其独特表现.本研究通过对DiART标记的简单蛋白样品、复杂蛋白样品以及复杂样品中目标蛋白的定量情况进行了分析,从而对DiART的定量特征进行了研究,并同时与iTRAQ进行了比较.结果表明,DiART方法在定量稳定性、准确性及动态范围方面均更具优势.     

特异性探针的使用

<正>为了用特异性探针检测检样中病原体的DNA,有必要使DNA相互反应形成双链DNA。在检测双链DNA时,必须预先标记特异性探针。有同位素标记和非同位素标记两种方法。用同位素标记者,在反应后洗去未反应的探针,仅测定放射强度便可。(图1)用非同位素法标记的DNA,在反应后,使之与碱性磷酸酶(ALP),过氧化物酶、β—D半乳糖苷酶等结合,以酶抗体法的原理检测杂交的DNA(图2)。由于最近市售一种与ALP直 (图1)用游离法杂交     

同位素标记法专题复习

同位素标记法是利用同位素的电离辐射对乳胶 (含AgBr或AgCl)的感光作用,对细胞内的生物大分子进行动态研究和追踪的一种细胞化学技术。包括: 同位素标记的大分子前体的掺入和细胞内同位素所在位置的显示。常用的同位素有:15N、35S、3H和14C等。研究DNA合成时通常用氚(3H)标记的胸腺嘧啶脱氧     

一种限制性核酸内切酶的荧光测活方法

到目前为止,发现的限制性核酸内切酶已超过475种,它们都来源于原核生物。限制性内切酶是遗传工程等工作中的重要的工具酶,同时也为研究两类最重要的生物大分子蛋白质和核酸之间的相互作用提供了一个理想的模型。要深入开展酶的性质、动力学、化学修饰以及结构与功能的研究,定量测活方法的建立是一个前提。此类酶的定量测活方法已有十余种,它们各有其优缺点,但至今还没有一种方法能达到既准确灵敏、简单方便,又普遍适用的程度。     

同位素标记相对和绝对定量技术研究进展

定量蛋白质组学是蛋白质研究的前沿学科。目前常用的定量蛋白质组学研究技术有荧光差异凝胶电泳（DIGE）、同位素亲和标记（ICAT）等。同位素标记相对和绝对定量（iTRAQ）技术是近年来最新开发的一种新的蛋白质组学定量研究技术。结合非凝胶串联质谱技术,该技术可对复杂样本、细胞器、细胞裂解液等样本进行相对和绝对定量研究,具有较好的定量效果、较高的重复性,并可对多达四种不同样本同时进行定量分析。本文对 iTRAQ 技术的原理、实验方法及应用进展进行了综述。     

增强化学发光免疫分析技术

将抗体或抗原以共价键或其它形式与酶偶合,形成酶标记抗体或酶标记抗原。酶标记抗原或抗体保留免疫学活性和酶学活性,因而既有抗原抗体反应的特异性,又有酶促反应的生物学放大作用。     

不同方法测定鸭血容量的比较研究

运用不同方法对 5只 6 0日龄高邮鸭血容量进行了比较性测定。染料法 :用T_182 4 (伊文思蓝 )染料法测血浆容量 ,再根据红细胞压积换算出血容量。同位素标记法 :以Na251 CrO4 标记法测红细胞容量 ,同时测定不同部位 (隐静脉、翼下静脉和心脏 )的红细胞压积。结合法 :血容量由染料法测得的血浆量和同位素标记法测得的红细胞容量相加而得。直接法 :颈部放血加上抽血的量。另取相同日龄高邮鸭 6只 ,同法注入T_182 4染料后分别于第 2、5、8、10分钟后另侧隐静脉抽取血样 ,离心后用于比色。四种不同测定方法测得的结果显示 ,红细胞标记法测得的…     

微板法在植酸酶活测定过程中的应用

在丙酮法测磷的基础上,在醇活测定时引入微板法。微板法是源于酶联免疫测定的一种新方法,用其进行植酸酶活测定时,可以大大提高工作效率,降低实验成本。并右减少测定过程中的人为误差。     

一种新的测定蛋白激酶活性的方法：毛细管电泳测定蛋…

建立了以毛细管电泳为基础的测定蛋白激酶Ａ活性的新方法,可作为激酶测活的通用方法。此法基于底物及其磷酸化产物很容易在毛细管电泳中分开,且酶活力可用积分值计算。同时又发发展了连续井样技术,能在一次电泳中同时进行１０个以上的酶活性测定。新方法操作简单,灵敏度和精确性均优于常规的同位素法。     

一种新的测定蛋白激酶活性的方法──毛细管电泳测定蛋白激酶A的活性

建立了以毛细管电泳为基础的测定蛋白激酶A活性的新方法,可作为激酶测活的通用方法．此法基于底物及其磷酸化产物很容易在毛细管电泳中分开,且酶活力可用积分值计算,同时又发展了连续进样技术,能在一次电泳中同时进行10个以上的酶活性测定,新方法操作简单,灵敏度和精确性均优于常规的同位素法．     

基于大环分子葫芦脲的鸟氨酸脱羧酶实时无标记活性分析方法的改进与应用

鸟氨酸脱羧酶 (Ornithine decarboxylase,ODC) 是多胺生物合成途径中的关键酶,其主要功能是催化鸟氨酸脱羧生成腐胺。在多种疾病和肿瘤细胞中,ODC的表达水平和催化活性都高于正常细胞,因此抑制ODC的活性是相关疾病预防和治疗的一个潜在途径。ODC抑制剂的发现和检验依赖于对其催化反应进程的监测,常采用的途径包括利用高效液相色谱法检测腐胺产量和利用同位素标记法检测二氧化碳的产量等。这些检测方法的繁琐操作和成本极大地限制了其应用,尤为突出的问题是这些方法很难实现高通量检测和实时检测。文中研究了基于大环分子葫芦[6]脲 (Cucurbit[6]uril,CB6) 与荧光染料DSMI (Trans-4-[4-(dimethylamino)styryl]-1-methylpyridinium iodide) 的ODC酶活实时无标记检测法,系统分析了其应用范围和局限性,并对其进行了优化。最后,利用优化后的方法实现了对不同机制ODC抑制剂的活性评价。     

嗜热菌Anoxybacillus sp．DL3产蛋白酶条件及其酶学性质研究

目的：对Anoxybacillussp．DL3的产蛋白酶条件及其酶学性质进行研究,为下一步进行蛋白酶基因的克隆、表达提供依据。方法：应用常规方法液体培养细菌,研究温度、pH、培养基中碳源、氮源对菌株产蛋白酶的影响,硫酸铵盐析的方法提取酶液,并采用Folin法测酶活性。用紫外分光光度计在OD680hi／1测吸光值。并对提取的蛋白酶液进行酶的最适温度、pH以及酶的热稳定性和pH稳定性研究,向酶液中添加金属离子和EDTA、PMSF,研究其对酶活性的影响。结果：在培养基初始pH是6．5,培养温度为40℃时菌株产酶酶活性最大;培养基中以乳糖为碳源,酵母膏和硫酸铵为氮源,碳源与氮源的比例为1：2时,酶活最大。酶学性质研究结果显示：该酶的最适反应温度是55℃,最适反应pH是7．0;在50℃保温20min-80min内,酶活力下降幅度较小。60℃保温60min后,仍保持约60％的酶活。70℃保温60min后,残余酶活为30％。该酶在pH为6．0～8．0范围内,相对酶活差别不是很大,下降趋势大致相同。在强碱条件下,相对酶活下降很明显。Fe2＋、Cu2＋和Hg2＋对酶活性有明显的抑制作用;Ca2＋、Mg^2＋、Mn2＋等金属离子对酶活性有明显的促进作用;乙二胺四乙酸（EDTA）和苯甲基磺酰氟（PMSF）对酶活性也有一定抑制作用。结论：Anoxybacillussp．DL3所产的蛋白酶为嗜热中性蛋白酶,此酶具有较好的热稳定性和pH耐受性,该菌株具有进一步开发、利用的价值。     

微生物快速诊断中的免疫荧光技术进展

早在1941年由Coons创立的免疫荧光(Immunofiuorescence IF) 技术,在六十年代以后有较大发展,已广泛应用于生物医学研究和临床诊断工作中,建立了直接法、间接法、抗补体法和混合球蛋白法等。近年来,随着免疫标记技术的发展,又出现了同位素标记、酶标记和化学发光免疫测定等技术,并日益受到重视。但是,IF由于具有光学显微镜形态学和     

评价新型稳定同位素赖氨酸标记在定量蛋白质组学中的应用

为了评价基于2-甲氧基-4,5-二氢-1氢-咪唑稳定同位素试剂在定量蛋白质组学中的应用价值,合成了轻型(D0)和重型(D4)的2-甲氧基-4,5-二氢-1氢-咪唑,通过对标准蛋白BSA酶解后产物的标记确认标记反应的特异性,并观察了标记物在MALDI-TOF-MS和LC-ESI-MS中定量的准确性,标记肽在串联质谱中的离子特点,以及对反相液相色谱行为的影响。结果表明,2-甲氧基-4,5-二氢-1氢-咪唑只与酶解后的肽段赖氨酸侧链氨基反应,具有良好的标记特异性;差异表达蛋白的定量可以通过MALDI和ESI电离模式实现;标记肽的串联质谱主要产生y离子,测序更为简便;反相液相色谱可以保持较好的分离效果,氘原子的引入不会影响保留时间,侧链修饰可以用于涉及液相色谱分离的蛋白质组学技术。2-甲氧基-4,5-二氢-1氢-咪唑稳定同位素试剂可以用于定量蛋白质组学。     

定量蛋白质组学中的同位素标记技术

定量蛋白质组学的目的是对复杂的混合体系中所有的蛋白质进行鉴定,并对蛋白质的量及量的变化进行准确的测定,是当前系统生物科学研究的重要内容。近年来,由于质谱技术和生物信息学的进步,定量蛋白质组学在分析蛋白质组或亚蛋白质组方面已取得了令人瞩目的成就,但其最显著的成就应该归功于稳定同位素标记技术的应用。该技术使用针对某一类蛋白具有特异性的化学探针来标记目的蛋白质或肽段,同时化学探针要求含有用以精确定量的稳定同位素信号。在此基础上,实现了对表达的蛋白质差异和翻译后修饰的蛋白质差异进行精确定量分析。综述了在定量蛋白质组学中使用的各种同位素标记技术及其应用。