融合表达新冠病毒S1与N蛋白的非复制型重组腺病毒的构建与鉴定

体外构建融合表达新型冠状病毒(SARS-CoV-2)S1抗原与N抗原的复制缺陷型重组腺病毒疫苗,为深入开展该疫苗免疫原性的研究提供基础。利用Overlap PCR和同源重组方法构建插入SARS-CoV-2的S1-N基因的重组腺病毒质粒pKAd5-S1-N,通过琼脂糖凝胶电泳、多酶切、测序等方法鉴定重组质粒正确性;重组质粒转染HEK293A细胞获得病毒毒种AdV5-S1-N并扩增,氯化铯密度梯度离心法纯化病毒,有限稀释分析法测病毒滴度,Western blot方法验证AdV5-S1-N重组腺病毒S1-N融合蛋白表达情况;将AdV5-S1-N疫苗通过肌肉注射途径免疫BALB/c小鼠,第14d采集颌下静脉血,ELISA法检测血清针对S1和N蛋白抗原的特异性抗体滴度。成功获得滴度为9.45×10¹¹IU/mL的重组腺病毒AdV5-S1-N。Western blot结果发现：AdV5-S1-N感染细胞后,融合蛋白可正常表达,与抗S1蛋白及抗N蛋白抗体均有特异结合。ELISA结果显示免疫重组腺病毒的小鼠可产生针对S1和N蛋白的特异性IgG抗体。应用复制缺陷型腺病毒载体成功获得...     

中东呼吸综合征冠状病毒S1蛋白在昆虫细胞中的重组表达及免疫效果评价

目的:利用昆虫杆状病毒表达系统重组表达中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-Co V)S1蛋白,并对其免疫效果进行评价。方法:构建含有MERS-Co V S1基因的重组杆状病毒质粒,转染Sf9细胞包装杆状病毒;重组病毒传代3次获得种子病毒,感染Sf9细胞,收获感染上清,通过镍离子亲和层析纯化获得S1重组蛋白;用纯化的S1蛋白免疫BALB/c小鼠,采用ELISA检测免疫小鼠血清抗原特异性的抗体水平;采用假病毒中和试验检测血清中抗体的中和活性。结果:获得了表达MERS-Co V S1蛋白的重组病毒株,在昆虫细胞中表达并纯化了S1重组蛋白;利用重组表达的S1蛋白免疫小鼠3次,血清S1特异性Ig G抗体滴度可达1∶102 400,免疫小鼠血清稀释至1/5120后中和百分比仍达50%以上。结论:利用昆虫细胞重组表达的MERS-Co V S1蛋白具有良好的免疫原性,并能有效诱导产生高滴度中和抗体,为发展MERS-Co V重组蛋白疫苗奠定了基础。     

O型口蹄疫病毒VP1基因与大肠杆菌不耐热肠毒素LTB 基因的融合表达及表达产物的免疫原性分析

以质粒pMDTLT为模板、用PCR的方法扩增出LTB基因,然后将其插入到pETVP1质粒中VP1基因的上游,构建了含有融合基因LTBVP1的表达质粒pETLTBVP1。转化宿主菌BL21(DE3)LysS后进行诱导表达,诱导菌经SDS-PAGE显示重组蛋白以包涵体的形式表达,分子量约为39kD;Western blotting分析表明,重组蛋白能与FMDV阳性血清及兔抗霍乱毒素(CT)血清反应,说明融合蛋白保持了LTB和VP1各自的免疫学活性。小鼠免疫实验表明:该融合蛋白通过腹腔接种小鼠能诱导产生较强的免疫应答反应,免疫鼠产生的血清抗体水平高于试验中商品口蹄疫疫苗免疫组。     

O型口蹄疫病毒VPl基因与大肠杆菌不耐热肠毒素LTB基因的融合表达及表达产物的免疫原性分析

以质粒pMDTLT为模板,用PCR的方法扩增出LTB基因,然后将其插入到pETVP1质粒中VP1基因的上游,构建了含有融合基因LTBVP1的表达质粒pETLTBVP1.转化宿主菌BL21(DE3)LysS后进行诱导表达,诱导菌经SDS-PAGE显示重组蛋白以包涵体的形式表达,分子量约为39 kD;Western blotting分析表明,重组蛋白能与FMDV阳性血清及兔抗霍乱毒素(CT)血清反应,说明融合蛋白保持了LTB和VP1各自的免疫学活性.小鼠免疫实验表明:该融合蛋白通过腹腔接种小鼠能诱导产生较强的免疫应答反应,免疫鼠产生的血清抗体水平高于试验中商品口蹄疫疫苗免疫组.     

核酸免疫制备鼠抗棉铃虫FK506结合蛋白的多克隆抗体

利用电注射基因导入法制备小鼠抗棉铃虫FK506结合蛋白(FKBP12)的多克隆抗体,并通过Western blot验证抗体与抗原的特异性结合。构建重组质粒pc DNA3-FKBP12并测序验证序列的正确性,利用基因导入法将重组质粒pc DNA3-FKBP12注射到小鼠体内,免疫4次后用ELISA检测法确定抗体的效价,并对抗体的特异性结合进行Western blot以及免疫组化检测。结果表明,小鼠抗FK506结合蛋白血清的效价达到1∶25 600,Western blot结果显示此抗血清能与融合蛋白His-FKBP12结合,免疫组化结果表明在棉铃虫3龄幼虫不同组织中FKBP12均有表达。说明电注射基因导入法制备的小鼠抗FK506结合蛋白的抗体在滴度和特异性结合方面都达到预期要求。     

人CD24分子成熟多肽的原核表达及抗体制备

目的: 为获得抗人CD24分子成熟多肽核心蛋白(hCD24N)的多克隆抗体。方法: 制备CD24表达阳性的人肿瘤细胞cDNA,采用PCR法扩增hCD24N的编码基因,构建pGEX-KGV-hCD24N原核表达质粒;转化大肠杆菌BL21(DE3),乳糖诱导表达;经GST亲和柱层析、SDS-PAGE和Western blotting制备并鉴定纯化的GST-StraptagII-hCD24N融合蛋白;免疫新西兰大白兔制备抗血清并用rProtein A亲和柱层析纯化多克隆IgG抗体;用间接ELISA法测定抗体效价,Western blotting鉴定抗体特异性,同时采用细胞免疫荧光检测技术对抗体的特异性和应用可行性作进一步评价。结果: 实现了hCD24N基因的克隆以及在原核细胞中的可溶性重组融合表达,得到了纯化后的目的融合蛋白,并以其为免疫原获得了效价高于1:100 000的抗hCD24N多克隆抗体,Western blotting及细胞免疫荧光检测证明该抗体与当前市售的抗人CD24抗体具有相似的免疫反应特异性,并且能够与CD24阳性人肿瘤细胞表达并加工的高度糖基化CD24天然分子发生特异性抗原-抗体反应。结论: 抗hCD24N多克隆抗体的成功制备为进一步以CD24分子为靶点的肿瘤生物学基础研究以及相关癌症的诊断试剂开发奠定基础。     

小鼠黑色素瘤相关抗原MART1的原核表达及抗体制备

目的:利用基因重组技术获得鼠黑色素瘤相关抗原MART1,并制备兔抗鼠多克隆抗体。方法:采用RT-PCR方法从小鼠黑素瘤B16-F1细胞株总RNA中扩增MART1的编码c DNA序列,并构建p ET32a-MART1原核表达质粒,将此质粒转化大肠杆菌Rosseta(DE3)菌株后用IPTG诱导表达,获得的MART1融合蛋白依次用Ni-NTA亲和层析和制备性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离纯化,纯化的MART1融合蛋白用SDS-PAGE和Western印迹鉴定;以纯化的MART1融合蛋白为抗原,皮内接种日本大耳白兔,制备多克隆抗体,采用ELISA、Western印迹和细胞免疫荧光法分别检测兔血清中抗体的效价及抗原的特异性。结果:构建出MART1原核表达质粒,小鼠MART1基因在大肠杆菌Rosseta(DE3)中可诱导性表达并有效纯化;用纯化的MART1蛋白在日本大耳白兔中制备出高效价的多克隆抗体(效价1∶1 024 000),该抗体可与原核及真核表达的MART1蛋白特异性结合。结论:建立了鼠MART1蛋白原核表达和纯化技术,制备出的高效价和特异性抗MART1多克隆抗体将为黑色素瘤的防治研究提供技术支撑。     

Nono蛋白的原核表达、纯化和多克隆抗体的制备

目的表达和纯化带多聚组氨酸（6×His）标签的Nono （ non-POU-domain-containing, octamer-binding protein ）融合蛋白并制备抗Nono多克隆抗体。方法构建pET-28a（＋）-Nono重组表达质粒,转入Rosetta（DE3）大肠埃希菌,以IPTG诱导6×His-Nono融合蛋白表达,经镍离子金属螯合树脂纯化后,用纯化出的蛋白免疫BALB／C小鼠制备多克隆抗体,并用ELISA检测多克隆抗体的效价,Western印迹检测多克隆抗体的特异性。结果在大肠埃希菌中诱导出高水平表达的His-Nono融合蛋白,经亲和树脂纯化后免疫小鼠,获得了高特异性的抗Nono抗血清。结论成功构建pET-28a（＋）-Nono原核表达质粒,表达并纯化出高纯度的目标蛋白,制备出高滴度、高特异性的多克隆抗体。     

猪FcγRIII的原核表达及多克隆抗体的制备

目的：构建猪FcγRIII 基因的原核表达载体,诱导表达重组蛋白,制备鼠抗猪 FcγRIII 抗血清。方法：从质粒pTG19-T-FcγRIII中用PCR方法克隆到编码完整猪FcγRIII蛋白分子的基因片段,将其插入到原核表达载体pET-32a中,构建了猪FcγRIII 原核表达载体pET-FcγRIII ,转化大肠杆菌BL21 (DE3) ,IPTG诱导蛋白表达,经尿素洗涤纯化后,以纯化后的融合蛋白FcγRIII-His 为抗原免疫小鼠,获得抗血清。Western blotting、ELISA 法鉴定获得的抗血清,ELISA 结果显示抗体效价为1∶16000,具有高度特异性,免疫印迹结果显示制备的多抗可以与重组猪FcγRIII蛋白特异性结合。结果：成功构建猪FcγRIII原核表达载体,纯化到融合蛋白FcγRIII-His,用纯化的融合蛋白免疫小鼠制备了多克隆抗体,Western blotting、ELISA 法证实多克隆抗体制备成功。结论：成功获得了猪 FcγRIII 多克隆抗体,为进一步研究猪FcγRIII 蛋白的功能奠定了基础。     

猪FcγRⅢ的原核表达及多克隆抗体的制备

目的:构建猪FcγRIII基因的原核表达载体,诱导表达重组蛋白,制备鼠抗猪FcγRIII抗血清。方法:从质粒pTG19-T-FcγRIII中用PCR方法克隆到编码完整猪FcγRIII蛋白分子的基因片段,将其插入到原核表达载体pET-32a中,构建了猪FcγRIII原核表达载体pET-FcγRIII,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导蛋白表达,经尿素洗涤纯化后,以纯化后的融合蛋白FcγRIII-His为抗原免疫小鼠,获得抗血清。Western blotting、ELISA法鉴定获得的抗血清,ELISA结果显示抗体效价为1∶16000,具有高度特异性,免疫印迹结果显示制备的多抗可以与重组猪FcγRIII蛋白特异性结合。结果:成功构建猪FcγRIII原核表达载体,纯化到融合蛋白FcγRIII-His,用纯化的融合蛋白免疫小鼠制备了多克隆抗体,Western blotting、ELISA法证实多克隆抗体制备成功。结论:成功获得了猪FcγRIII多克隆抗体,为进一步研究猪FcγRIII蛋白的功能奠定了基础。     

小鼠睾丸特异性基因Vad1.2重组蛋白的构建及多克隆抗体制备

目的：构建小鼠睾丸特异性基因Vad1.2重组蛋白,制备多克隆抗体。方法：将小鼠睾丸组织Vad1.2转录本行RT-PCR扩增,通过DNA重组技术插入克隆载体p ET15b,进行酶切及DNA序列分析。将表达载体转化入大肠杆菌BL21（DE3）RIL感受态细胞,10 mmol/L IPTG诱导表达重组蛋白,通过10%SDS-PAGE、Western blotting及质谱分析进行鉴定。随后对重组Vad1.2蛋白进行纯化和进一步鉴定。最后,制备兔抗小鼠Vad1.2多克隆抗体,并通过Vad1.2-EGFP质粒转染GC-2spd（ts）细胞对其特异性进行验证。结果：大肠杆菌BL21（DE3）RIL细胞中诱导表达并纯化的小鼠Vad1.2重组蛋白构建正确并经Western blotting和质谱分析得到证实。所制备的多克隆抗体可特异性识别GC-2spd（ts）细胞中过表达的Vad1.2-EGFP融合蛋白。结论：成功构建小鼠Vad1.2重组蛋白,并制备多克隆抗体,为Vad1.2基因的进一步研究奠定了实验基础。     

重组人骨硬化蛋白的表达、纯化及多克隆抗体制备

[目的]构建人骨硬化蛋白(Sclerostin,SOST)原核载体,表达、纯化SOST蛋白,制备与鉴定小鼠多克隆抗体。[方法]通过分子克隆获得SOST蛋白的表达菌株;利用SDS-PAGE电泳切胶纯化、尿素梯度复性获得SOST蛋白,免疫小鼠制备SOST蛋白多克隆抗体;采用ELISA法检测抗体滴度;Western blotting检测抗血清特异性;DNAMAN与MEGA软件分析SOST蛋白系统进化关系。[结果]SOST重组载体双酶切、DNA测序鉴定结果,以及蛋白表达、纯化条带大小与预测一致。ELISA法获得SOST抗血清滴度达1:6 400倍,Western blotting证实抗血清具有很好的特异性。SOST序列的系统发生分析发现动物具有显著不同的进化趋势。[结论]成功克隆、表达与纯化SOST蛋白,制备并鉴定小鼠多克隆抗体。为SOST蛋白功能研究奠定基础。     

冠状病毒HCoV-229E S1蛋白片段的免疫原性分析

目的表达和纯化HCoV-229E的S1蛋白片段（S1 417-547）,分析其诱导的免疫应答。方法将纯化蛋白免疫小鼠,ELISA检测小鼠血清特异性抗体以及血清IL-4和IFN-γ含量,流式细胞术检测小鼠脾脏T淋巴细胞亚群分布,观察其诱导的免疫应答。结果表达蛋白经金属螯合获得纯化,并诱导小鼠产生了高滴度的抗体。脾脏CD4^＋和CD8^＋比例均升高,CD4^＋/CD8^＋比值下降;免疫鼠血清IFN-γ和IL-4水平显著升高。结论成功构建了HCoV-229E S1蛋白的表达载体,并在BL21（DE3）中得到了高效表达,表达蛋白免疫小鼠后诱导了明显的细胞和体液免疫应答。     

Toll样受体5激动剂CBLB502-Fc融合蛋白的表达纯化及初步鉴定

目的:构建Toll样受体5激动剂CBLB502-Fc融合蛋白的真核表达载体,并在CHO细胞中表达,纯化得到具有生物学活性的目的蛋白。方法:首先从合成的pUC57-CBLB502质粒中扩增出CBLB502基因片段,酶切后克隆至pUC57-Fc质粒中,然后双酶切pc DNA3.1和pUC57-CBLB502-Fc,将CBLB502-Fc基因片段克隆至载体pc DNA3.1,挑选阳性克隆并测序,再将重组质粒转染CHO细胞,筛选高表达细胞系,用免疫印迹鉴定表达情况,Protein A亲和柱纯化目的蛋白,SDS-PAGE鉴定目的蛋白,用小鼠辐射试验初步验证目的蛋白的生物学活性。结果:构建了pc DNA3.1-CBLB502-Fc真核表达载体;转染CHO细胞,筛选得到CBLB502-Fc高表达细胞系,并经免疫印迹鉴定培养上清;纯化得到较高纯度的融合蛋白并经SDS-PAGE鉴定;小鼠辐射实验表明CBLB502-Fc具有抗辐射作用。结论:真核表达并纯化了具有抗辐射作用CBLB502-Fc融合蛋白,为后续研究CBLB502-Fc的生物学功能奠定了重要基础。     

GST-HRB融合蛋白的表达与纯化

构建GST-HRB重组质粒,进行融合蛋白的表达、纯化及鉴定.利用PCR扩增及基因重组技术,以pcDNA-3.1-HRB为模板扩增出HRB全基因序列,并将其插入带有GST(谷胱甘肽巯基转移酶)标签的原核表达载体pGEX-6P-1中,构建GST-HRB融合蛋白表达质粒.然后,将重组质粒GST-HRB转化至大肠杆菌Rosseta进行融合蛋白的表达.利用GST琼脂糖珠进行融合蛋白的纯化,最后应用SDS-PAGE电泳和Western blotting鉴定纯化的融合蛋白.结果表明,成功构建pGEX-6P-1-HRB原核表达载体,表达及纯化了GST-HRB融合蛋白.     

采用免疫亲和色谱方法从骆驼血清中纯化抗CD47特异性抗体

本研究从骆驼血清中制备抗CD47特异性抗体并分析其与重组蛋白CD47和EC9706细胞膜表面CD47结合情况。从骆驼血清中纯化出总Ig G,再利用偶联上CD47的CNBr琼脂糖树脂免疫亲和纯化出抗CD47特异性抗体,通过ELISA和Western blotting验证其结合情况,通过细胞ELISA鉴定抗CD47特异性抗体与食管癌细胞膜表面CD47结合。结果显示通过两步免疫亲和色谱成功获得抗CD47特异性抗体,ELISA和Western blotting说明该抗体与重组蛋白CD47有强的结合活性和特异性,细胞ELISA检测抗CD47抗体浓度在20μg/mL时与EC9706细胞表面CD47有较好的结合。本研究首次利用免疫亲和色谱方法从骆驼血清中获得抗CD47特异性抗体,并与食管癌细胞有一定的结合活性,为肿瘤靶向治疗提供了可能。     

血清学诊断中结核杆菌磷酸烯醇型丙酮酸羧激酶的应用

[目的]在原核系统中表达结核杆菌磷酸烯醇型丙酮酸羧激酶(phosphoenolpyruvate car-boxykinase PEPCK),并研究该蛋白在诊断结核病人血清抗体中的应用价值.[方法]应用基因重组技术表达重组蛋白结核杆菌磷酸烯醇型丙酮酸羧激酶,经亲和层析法纯化表达产物.用表达的重组蛋白免疫小鼠,研究其免疫学特性.间接酶联免疫吸附试验(Enzyme link immunosorbent assay,ELISA)检测结核病人血清中特异性IgG抗体,并与结核杆菌抗体胶体金法诊断试剂盒检测结果对比.[结果]试验表明转化入大肠杆菌中的重组质粒能够表达并纯化出相对分子量为72 kDa的重组蛋白;Western blot证实重组蛋白能够与小鼠抗BCG血清发生特异性反应;重组蛋白免疫小鼠后,小鼠血清中的抗体滴度可达1∶1280以上;重组蛋白用作ELISA包被抗原检测病人血清阳性率为17.3%(30/173),其中排菌病人的阳性率为32.5%(13/42),不排菌病人的阳性率为12.9%.该方法结果与结核杆菌抗体胶体金法诊断试剂盒的检测结果相比,敏感性为51.0%,特异性为96.7%.[结论]结核杆菌PEPCK具有较好的免疫原性和抗原性,有可能作为结核病血清学诊断的一组抗原之一.     

呼吸道合胞病毒重组蛋白候选疫苗的质粒构建、表达及免疫原性和保护性研究

PCR扩增呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus,RSV）M2 蛋白的CD8＋T细胞表位F/M2:81-95和RSV-G蛋白的B细胞表位片段G:125～225（简称G1）,以一个Linker连接,插入质粒pET-DsbA中构建原核表达重组质粒, 转染E.coli BL21(DE3)后成功表达了融合蛋白DsbA-G1-Linker-F/M2:81-95（简称D-G1LF/M2）,Western-blot结果表明该融合蛋白是RSV特异性的,采用Ni+螯合亲和层析法纯化变性的包涵体溶液,经梯度透析法复性,用该蛋白免疫BALB/c小鼠,结果表明被免疫小鼠肺部及血清中产生了高滴度的抗D-G1LF/M2及抗RSV IgG抗体和中和抗体,同时还诱导产生了RSV特异性的CTL应答;IgG的亚型IgG1/IgG2a的比值为2.66;用RSV攻击免疫后的小鼠,病毒滴定法检测肺部RSV滴度,结果表明D-G1LF/M2对小鼠肺部具有保护作用。     

HBV前S2蛋白单克隆抗体的制备和生物学特性的鉴定

目的克隆表达HBV前S2蛋白,用纯化的重组蛋白GST-S2免疫BALB/C小鼠,通过杂交瘤技术制备抗HBV前S2蛋白的单克隆抗体(mAb),并鉴定其特性.方法利用含双拷贝乙肝病毒adw2亚型基因全序列的质粒pEcob6,经PCR方法扩增出HBV前S2片段,在GST表达系统中表达,表达产物用谷胱甘肽亲和层析纯化后,用于免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备抗前S2蛋白的mAb,采用间接ELISA方法和Western blot进行mAb特异性鉴定;同时采用间接ELISA方法鉴定mAb相对亲和力.结果获得一株可分泌特异性mAb的杂交瘤细胞7A6;相对亲和力均在107以上.Western blot显示该株mAb能特异识别重组前S2蛋白.结论成功地制备出抗HBV前S2蛋白的一株mAb.     

抗CD47胞外区骆驼多克隆抗体的制备及鉴定

验证人CD47蛋白能否在新疆双峰驼中产生高滴度抗体;为制备高亲和力的抗CD47纳米抗体提供实验依据。构建CD47胞外区原核表达载体,诱导表达及纯化CD47蛋白,免疫新疆双峰驼。通过酶联免疫吸附试验(ELISA)和Western blot分别检测骆驼多克隆抗体的效价及与CD47蛋白特异性结合活性。结果显示,成功构建CD47胞外区原核表达载体,获得纯度大于90%的CD47蛋白,表达纯化的CD47重组蛋白可与抗CD47单抗B6H12.2特异结合;ELISA测定CD47重组蛋白免疫骆驼7次后,抗CD47多克隆抗血清的效价至少达到1∶200 000,免疫印迹检测表明抗CD47骆驼抗血清与CD47重组蛋白、Jurkat和Raji细胞表面表达的CD47均能特异结合。重组人CD47蛋白可以在骆驼体内激发高滴度抗体反应。