中东呼吸综合征冠状病毒假病毒系统的建立及其在中和抗体检测中的应用

目的:为了避免中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)感染与中和试验中操作活病毒带来的生物安全隐患,构建只具有一次感染能力而无复制能力的MERS假病毒,建立MERS假病毒系统,并应用于中和抗体检测。方法:构建含有MERS-CoV S基因的重组质粒pcDNA3.1-MERS-S,与缺失Env基因、含有萤光素酶报告基因的HIV-1骨架质粒pNL4-3.Luc.RE共转染293T细胞,收获含有假病毒的上清;通过Western印迹、细胞感染实验和血清中和试验,确定是否包装出MERS假病毒,及是否能有效应用于细胞感染与中和试验。结果:MERS假病毒pMERS-S培养上清经Western印迹鉴定出相对分子质量为25×103的HIV-1 P24蛋白和相对分子质量为180×103的MERS-CoV S蛋白;与阴性对照假病毒pEnv-相比,pMERS-S能有效感染MERS-CoV敏感细胞系Huh-7,在感染细胞中产生荧光信号,感染细胞的假病毒量与产生的荧光信号呈明显的量效关系;在MERS假病毒中和试验中,pMERS-S能被MERS-CoV中和抗体中和而失去感染力,反映抗体对MERS-CoV的中和活性。结论:建立了不依赖于BSL-3高等级生物安全条件的MERS假病毒系统,并有效应用于中和抗体检测,为MERS-CoV疫苗、药物评价及病毒致病机制研究提供了良好的技术支撑手段。     

以EV71 3Cpro为靶标的抗病毒药物筛选模型的建立及抗3Cpro化合物筛选

建立一种以EV71 3C蛋白酶为靶标的抗肠病毒药物筛选模型,并应用于小分子化合物库筛选具有抗EV71活性的化合物.从临床手足口病例标本中分离肠道病毒进行PCR鉴定及基因组测序.通过插入突变在黄色荧光YFP编码框合适位点处引入EV71 3C酶切位点,构建对3C蛋白酶敏感的报告质粒pc DNA3-m YFP,然后将其与表达3C的质粒共转293A细胞,在3C抑制剂Rupintrivir存在与否的情况下通过荧光显微镜和酶标仪检测Ex(500nm)/Em(535nm)荧光信号的变化,判断建模是否成功;利用建好的筛选模型在高通量药物筛选平台对小分子化合物库进行初筛和复筛;再利用空斑分析检测筛选出的活性化合物是否对临床分离的EV71毒株具有抑制作用.m YFP在293A细胞中表达良好,3C的表达使荧光信号下降80%,Rupintrivir的存在则几乎不影响荧光表达,说明以3C为靶位的筛选模型构建成功.经过高通量初筛和复筛从26 000多种小分子化合物中获得26种能够显著回复m YFP表达的活性化合物;空斑分析显示其中2种化合物具有较为明显的抑制EV71复制的活性.因此,我们所构建的3C-m YFP共表达系统是一种简便有效的、可用于高通量筛选抗EV71 3C~(pro)药物的筛选模型.     

不同浓度复合肥对松材线虫病抗性马尾松采穗圃萌条和穗条扦插的影响

以2.5 g·L^-1、5.0 g·L^-1、10.0 g·L^-1三个浓度复合肥对采穗圃进行施肥试验,研究不同浓度复合肥对松材线虫病抗性马尾松采穗圃的产穗和穗条扦插的影响。结果表明,与空白对照相比,施用复合肥使萌条数量,穗条扦插的生根率、不定根数量、最长不定根、总根长和侧根数增加。不同浓度复合肥对性状的影响不同。复合肥2.5 g·L^-1最有利于萌条数量增加,较对照增加106%,差异达显著水平;5.0 g·L^-1最有利于提高不定根数、总根长和侧根数,较对照分别提高100.0%、189.1%和186.4%,其中总根长差异达极显著水平,侧根数达显著水平;10.0 g·L^-1最有利于提高生根率和最长不定根长度,较对照分别上升23.2%和134.7%,其中最长不定根差异达极显著水平。综合评价10项萌条和生根性状,复合肥10.0 g·L^-1综合目标值最高,是三个浓度中最佳施肥浓度。     

南盘江流域铁坚油杉种群空间结构特征分析

铁坚油杉[Keteleeria davidiana(Bertr.)Beissn]为第三纪残遗裸子植物,被列为中国濒危树种,也是南盘江流域天然植被的重要组分。该研究于南盘江流域的广西雅长兰科植物国家级自然保护区内,采用典型样地法建立了1块面积为100m×80m的永久性标准固定样地,并运用林分空间结构参数二元分布(BDFSSSP)法分析铁坚油杉种群整体、大树(DBH≥15.79cm)和小树(5cm≤DHB15.79cm)的空间结构特征,以揭示南盘江流域内天然次生群落中铁坚油杉种群的结构多样性。结果表明:(1)铁坚油杉种群整体处于随机偏向均匀分布(W=0.468)状态,混交度适中(M=0.480),个体径阶分化明显(U=0.472)。(2)多数大树同时处于优势地位(U=0.204)和中度混交(M=0.436)状态,格局为随机分布(W=0.483)。(3)小树的分布格局和混交状态与种群整体相似,但大部分小树都是劣势木(U=0.75~1.00)。研究认为,南盘江流域铁坚油杉种群与其相邻种群之间的空间结构具有多样性,铁坚油杉种群内部的空间结构也具有多样性,暗示整个种群可能处于稳定状态。     

中东呼吸综合征冠状病毒S1蛋白在昆虫细胞中的重组表达及免疫效果评价

目的:利用昆虫杆状病毒表达系统重组表达中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-Co V)S1蛋白,并对其免疫效果进行评价。方法:构建含有MERS-Co V S1基因的重组杆状病毒质粒,转染Sf9细胞包装杆状病毒;重组病毒传代3次获得种子病毒,感染Sf9细胞,收获感染上清,通过镍离子亲和层析纯化获得S1重组蛋白;用纯化的S1蛋白免疫BALB/c小鼠,采用ELISA检测免疫小鼠血清抗原特异性的抗体水平;采用假病毒中和试验检测血清中抗体的中和活性。结果:获得了表达MERS-Co V S1蛋白的重组病毒株,在昆虫细胞中表达并纯化了S1重组蛋白;利用重组表达的S1蛋白免疫小鼠3次,血清S1特异性Ig G抗体滴度可达1∶102 400,免疫小鼠血清稀释至1/5120后中和百分比仍达50%以上。结论:利用昆虫细胞重组表达的MERS-Co V S1蛋白具有良好的免疫原性,并能有效诱导产生高滴度中和抗体,为发展MERS-Co V重组蛋白疫苗奠定了基础。     

施氮及不同根系分隔模式对尾叶桉和降香黄檀幼苗生长及叶片生理特性的影响

豆科与非豆科树种混交作为一种人工林培育可持续发展模式,在保证木材产量和维持氮素平衡中发挥了重要作用。该研究通过大棚盆栽试验,设计3个施氮水平(0、3、6g·株-1)及3种根系分隔方式(不隔、网隔、膜隔),分析了不同氮素水平及根系分隔模式对尾叶桉(Eucalyptus urophylla)与降香黄檀(Dalbergia odorifera)植株幼苗生长、叶片生理特性、根系形态及生物量的影响。结果表明:(1)随施氮量的增加,尾叶桉与降香黄檀的苗高、地径均呈递增趋势;不同根系分隔模式下,尾叶桉苗高、地径均在不隔模式下生长最好,降香黄檀则在膜隔模式下生长最好。(2)与不施氮处理相比,施氮3、6g·株-1水平下尾叶桉与降香黄檀叶片的超氧化物歧化酶(SOD)活性、过氧化物酶(POD)活性及可溶性蛋白含量均显著升高,而丙二醛(MDA)含量则呈降低趋势。(3)尾叶桉与降香黄檀根系的总长度、总表面积、总体积、平均直径、根尖数和比根长均随氮素水平的增加而增加,且各氮素水平间的差异显著;同一氮素水平下,尾叶桉的根系生长总体表现为不隔网隔膜隔,而降香黄檀根系生长则表现为膜隔不隔网隔,且两树种不同分隔模式间差异显著。(4)尾叶桉与降香黄檀各器官生物量及总生物量均随施氮量的增加而增加,并在6g·株-1施氮水平下生物量最大;各器官生物量分配中,尾叶桉各器官生物量所占比例大小依次为:茎(40.59%)叶(32.37%)根(27.04%),降香黄檀各器官生物量所占比例大小依次为:根(47.67%)茎(40.08%)叶(12.25%)。研究表明,尾叶桉与降香黄檀混交一定程度上扩展了根系横向和纵向水平的养分生态位,扩大了根系吸收土壤养分的空间,同时根系互作提高了降香黄檀的固氮能力,对土壤有效氮的产生有较大影响。     

红花檵木LcFLS1基因的克隆及其表达与转化研究

该研究以红花檵木(Loropetalum chinense var.rubrum)为材料,根据转录组测序结果和PCR方法克隆到1个黄酮醇合成酶(FLS)同源基因,命名为LcFLS1。生物信息学分析显示,LcFLS1的开放阅读框为996bp,编码331个氨基酸。氨基酸序列分析显示,LcFLS1具有典型的2-酮戊二酸和铁依赖性双加氧酶结构域;蛋白结构预测表明,球形蛋白结构的核心区域存在10个与2-酮戊二酸配体互作的位点。进化树分析结果表明,LcFLS1与茶树(Camellia sinensis)等木本植物的亲缘关系较近,而与拟南芥(Arabidopsis thaliana)等草本植物的亲缘关系较远。荧光定量PCR检测显示,LcFLS1在红花檵木的花中相对表达量最高,而在茎中最少。成功构建了LcFLS1基因的过表达载体pLcFLS1-SUPER1300,经农杆菌侵染花序法将pLcFLS1-SUPER1300质粒转入拟南芥中获得转基因植株,PCR鉴定表明获得了转LcFLS1基因拟南芥阳性植株。该研究结果为红花檵木黄酮醇的生物合成机制研究,以及药用价值的开发利用奠定了基础。     

人H7N9禽流感病毒与H1N1流感病毒感染小鼠病理学损伤的比较

目的比较分析H7N9病毒与H1N1病毒感染小鼠病理学损伤特点,初步探讨两种病毒感染致小鼠急性肺损伤的致病机制。方法 H7N9病毒与H1N1病毒分别感染小鼠,观察不同病毒感染后小鼠生存率,并于不同时间点取心、肝、脾、肺、肾、脑、肠等组织,伊红-苏木素染色并进行组织病理学分析,免疫组化检测病毒抗原分布及中性粒细胞浸润。综合分析肺组织病理损伤与病毒复制、宿主免疫反应之间的关系。结果 H7N9病毒感染小鼠肺及脾脏损伤较轻,存活率较高。H1N1病毒感染的小鼠肺及脾脏损伤较重,感染后9 d全部死亡;两种病毒抗原主要分布于支气管上皮细胞、少量间质细胞和肺泡上皮细胞,病毒复制水平无明显差异。但H1N1病毒感染后肺及脾脏中均有大量中性粒细胞浸润,小鼠机体炎症反应明显强于H7N9病毒感染后小鼠炎症反应。结论 H7N9病毒与H1N1病毒感染后小鼠病理学损伤特点及程度均不同,病毒复制是小鼠肺损伤的诱发因素但并非决定因素,宿主针对病毒感染产生的免疫反应程度与急性肺损伤密切相关。     

水稻耐盐响应中钾运输载体的研究进展北大核心CSCD

水稻是全球主要粮食作物之一，随着种植区盐渍化加剧，其产量及安全已受到严重威胁。土壤中过高的盐浓度使细胞内Na+过量累积，K/Na失衡，造成离子毒害和渗透胁迫。为减轻盐胁迫带来的生长抑制，水稻进化出一系列适应性机制，包括钾运输载体对K+的摄取或运输以及对Na+的区隔化或外排。水稻中介导这些过程的钾运输载体家族可划分为Shaker、TPK、KT/HAK/KUP、HKT和CPA五大家族。本文总结了上述水稻钾运输载体在盐胁迫下的功能作用及调控机制的研究进展，并对未来研究前景予以展望。