赖氨葡锌颗粒中盐酸赖氨酸含量测定方法改进

目的:建立HPLC法测定赖氨葡锌颗粒中盐酸赖氨酸含量。方法:色谱柱为μBondpark C18柱,以甲醇:0.05mol/L醋酸钠和醋酸溶液(65:35)作为流动相,流速为1.0ml.min-1,检测波长为360nm。结果:盐酸赖氨酸在2.4~24.6μg/ml的浓度范围内呈良好的线性关系,平均回收率为99.28%,RSD=1.0%(n=6)。结论:建立的方法简便、快速、重现性好、结果准确,可用于赖氨酸的含量测定。     

链霉菌Streptomyces sp. M-Z18转化前体L-赖氨酸合成ε-聚赖氨酸的研究

目的:考察不同细胞培养方式对Streptomyces sp. M-Z18转化前体L-赖氨酸合成ε-聚赖氨酸过程的影响。方法:利用两阶段细胞培养和发酵过程流加方式,建立了两阶段细胞培养转化前体L-赖氨酸合成ε-聚赖氨酸以及转化前体L-赖氨酸耦合甘油发酵生产ε-聚赖氨酸的策略。结果:(1)两阶段细胞培养转化前体L-赖氨酸合成ε-聚赖氨酸策略实现ε-PL积累15 g/L, 转化L-赖氨酸3 g/L;(2)转化前体L-赖氨酸耦合甘油发酵生产ε-聚赖氨酸策略使得ε-PL产量达到33.76 g/L,单位菌体的合成能力提高37.8%,转化L-赖氨酸4 g/L。这表明,上述两种方式下前体L-赖氨酸都能够被Streptomyces sp. M-Z18转化合成ε-聚赖氨酸,但转化效率还有待进一步提高。意义:揭示了Streptomyces sp. M-Z18合成ε-聚赖氨酸的限速步骤在于初级代谢产物L-赖氨酸的合成,这为后续利用代谢工程手段改造菌株提供了方向。     

L-赖氨酸高产菌的选育及发酵培养基的优化

目的:获得L-赖氨酸高产菌及得到最优的发酵培养基.方法:以黄色短杆菌(Brebvibacterium flavum)XQ-8为出发菌株,经硫酸二乙酯(DES)、亚硝基胍(NTG)逐级诱变处理,在发酵培养基中添加乙酸和乙醇,在发酵过程中添加吐温-80和二甲基亚砜.结果:获得一株L-赖氨酸高产菌XQ-89(SGгVal-),摇瓶发酵72h赖氨酸产量达到77g/L,对乙酸、吐温-80和玉米浆三因素利用响应面分析法(Response Surface Methodology)对其添加量进行优化.当乙酸、吐温-80及玉米浆的添加量分别为0.32%、0.66%、1.5%时赖氨酸达到94g/L,比优化前提高22.1%.结论:筛选的(SGгVal-)标记是有利于L-赖氨酸的积累,添加乙酸和吐温-80对提高L-赖氨酸的产量是有效的.     

过量表达钝齿棒杆菌柠檬酸合酶编码基因prpC2对L-精氨酸合成的影响

钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum)SYPA5-5是诱变选育的一株高产精氨酸菌株。柠檬酸合酶作为TCA途径的关键酶,对细胞胞内氨基酸代谢流调节有重要作用。在钝齿棒杆菌SYPA5-5中过量表达同源的柠檬酸合酶(citrate synthase)基因prp C2,研究其对精氨酸及副产物合成的影响。重组菌C.crenatum SYPA5-5/p DXW-10-prp C2胞内柠檬酸合酶比酶活提高了5.37倍,使L-精氨酸产量在5L发酵罐中达到44.7g/L,与对照相比提高了23.1%。同时,有机酸测定分析TCA循环的精氨酸前体柠檬酸及异柠檬酸的量有所提高,且赖氨酸合成前体草酰乙酸量减少,氨基酸测定分析L-精氨酸发酵中最主要的副产物L-赖氨酸浓度由原来的5.96g/L降到1.21g/L,降低了80%。     

高效液相色谱法测定注射用盐酸吉西他滨含量测定

目的:建立高效液相色谱法测定注射用盐酸吉西他滨的含量。方法:采用高效液相色谱法,色谱柱:Aglea Venusil XBP C8 4.6×250mm 5um;流动相:以醋酸铵缓冲液(取醋酸铵3.85g加水800ml使溶解,加冰醋酸调p H值至5.7,加水1000ml)-甲醇(90:10)为流动相,检测波长268nm。结果:盐酸吉西他滨线性为y=944.25x+4608.5,r=0.9998,溶液在70.64 ng/ml~131.20ng/ml的浓度范围内线性关系良好;平均回收率为99.89%,RSD为0.53%(n=9),重复性RSD=0.12%(n=6);结论:该方法简便,线性、重复性好、准确度高,采用此方法能准确测定注射用盐酸吉西他滨含量。     

代谢过程中相关氨基酸对高密度发酵生产腺苷蛋氨酸的影响

对清酒酵母高密度发酵生产S-腺苷-L-蛋氨酸（SAM）代谢过程中的相关氨基酸进行了考察。分别考察了十二种氨基酸对生物量和SAM产量的影响。实验发现L-胱氨酸、L-半胱氨酸、L-赖氨酸、L-组氨酸和L-蛋氨酸对SAM的积累有利,其中L-赖氨酸和L-组氨酸可以提高生物量,进而提高SAM的产量;L-胱氨酸、L-半胱氨酸和L-蛋氨酸可以提高SAM的含量,但是会抑制生物量的增长。通过3种补加方式的比较,得到最优的补加方式为：L-赖氨酸和L-组氨酸在培养基中加入,L-胱氨酸,L-半胱氨酸和L-蛋氨酸采取在发酵过程前24h流加。通过正交实验确定补加量为：L-赖氨酸为1g／L,L-组氨酸为1g／L,L-胱氨酸为1．5g／L,L-半胱氨酸为1g／L,L-蛋氨酸为1g／L。将此结果应用于5L发酵罐培养,SAM最高产量为5．53g/L,生物量为128g／L。     

一株高产脯氨酸的嗜醋酸棒杆菌的选育及发酵条件优化

以嗜醋酸棒杆菌为出发菌株,经过片段化全基因组体外诱变、重组和连续的磺胺胍抗性筛选,获得一株L-脯氨酸的高产菌株。摇瓶发酵优化结果表明,葡萄糖、生物素和硫胺素的最适用量分别为16%、300μg/L、400μg/L,最适pH为6.8~7.0,装液量为25ml/500ml摇瓶,发酵培养72h后L-脯氨酸产率高达到75.6g/L,与对照相比提高了5%。考察了50L发酵罐中细胞生长对L-脯氨酸产量的影响,补料分批发酵结果表明(比生长速率分别为0.06/h、0.08/h和0.1/h),比生长速率在0.08/h左右时L-脯氨酸的产率最高,L-脯氨酸的比生产速率Q_P达到0.091 g/(g.h),产率高达82.1 g/L,比优化前提高了14%。     

L-苹果酸产生菌F-871变株合成延胡索酸酶的研究*

温特曲霉AspergilluswentiiF-871是高效转化延胡索酸为L-苹果酸的变株,通过对其合成延胡索酸酶的因素进行研究,筛选了培养基主要营养元素有L-精氨酸、酪氨酸、丝氨酸、天冬氨酸、苏氨酸、赖氨酸及相应含量丰富的酵母粉、黄豆饼粉和玉米浆。该变株生长阶段条件为:pH6.0,温度2830℃,培养时间为24h,酶合成阶段最适条件:接种量15%,初始pH6.8,培养温度2830℃,装量8090ml/500ml,酶合成周期40h。在优化的培养条件下,F-871变株延胡索酸酶合成水平可达156.33u/g,100ml发酵液中的酶可将延胡索酸转化为L-苹果酸32.06g,比国内一步发酵法产酸88.5%提高约4倍,转化率由85%提高到106.87%,发酵周期由90h缩短至57h。     

L-苹果酸产生菌F-871变株合成延胡索酸酶的研究

温特曲霉AspergilluswentiiF-871是高效转化延胡索酸为L-苹果酸的变株,通过对其合成延胡索酸酶的因素进行研究,筛选了培养基主要营养元素有L-精氨酸、酪氨酸、丝氨酸、天冬氨酸、苏氨酸、赖氨酸及相应含量丰富的酵母粉、黄豆饼粉和玉米浆。该变株生长阶段条件为:pH6.0,温度2830℃,培养时间为24h,酶合成阶段最适条件:接种量15%,初始pH6.8,培养温度2830℃,装量8090ml/500ml,酶合成周期40h。在优化的培养条件下,F-871变株延胡索酸酶合成水平可达156.33u/g,100ml发酵液中的酶可将延胡索酸转化为L-苹果酸32.06g,比国内一步发酵法产酸88.5%提高约4倍,转化率由85%提高到106.87%,发酵周期由90h缩短至57h。     

复方黄柏液的质量标准研究

本研究旨在建立复方黄柏液质量标准控制方法。实验采用薄层色谱法与高效液相色谱法对复方黄柏液中的盐酸小糪碱、绿原酸进行定性鉴别及含量测定。结果表明,复方黄柏液的盐酸小糪碱、绿原酸的薄层色谱中,在与对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点,阴性无干扰;HPLC 法测定盐酸小糪碱进样量在0.09～ 0.45 μg（r = 0.9998）范围内线性关系良好,平均加样回收率为103.4%;绿原酸进样量在0.9～4.5 μg（r = 0.9999）范围内峰面积线性关系良好,平均加样回收率为100.2%。检测出复方黄柏液中盐酸小糪碱含量平均为0.0222 mg/ml,绿原酸含量平均为0.382 mg/ml。研究证明,该方法可用于复方黄柏液的质量控制。     

RP-HPLC法测定盐酸托莫西汀的含量和有关物质

目的:建立RP-HPLC法测定盐酸托莫西汀的含量和有关物质.方法:采用Kromasil C18(4.6mm×250 mm,5μm)色谱柱,流动相:乙腈-水-三乙胺溶液(40:60:0.5,冰醋酸调pH至6.0),流速:1.0 mL·min-1,检测波长:270 nm,柱温:室温.结果:有关物质与盐酸托莫西汀分离良好,盐酸托莫西汀在2.0～50.0mg·L-1 范围内线性关系良好(r=:0.9998),平均回收率为99.8%(RSD=1.7%),检测限为80 μg·L-1(S/N=3).盐酸托莫西汀与有关物质分离良好.结论:该方法操作简便、重复性好、专属性强,可用于测定盐酸托莫西汀的含量和有关物质.     

HPLC-ELSD测定抗宫炎片中盐酸水苏碱的含量

目的 建立HPLC-ELSD法测定抗宫炎片中盐酸水苏碱的含量.方法采用Lichrospher 5-NH2色谱柱,流动相为乙腈-水（86∶14）,流速1.0 ml/min,柱温30℃;检测器参数：雾化室温度60℃,漂移管温度80℃,载气体积流量1.2 ml/min.结果盐酸水苏碱在2.654~13.270 μg范围内线性关系良好,r=0.9994,平均回收率为97.7%,RSD=1.9%（n=6）.结论 该法简便可行,结果准确可靠,可用于抗宫炎片中盐酸水苏碱的含量测定.     

春兰ב寒香梅’试管开花诱导及其生理基础

以春兰×寒香梅杂交种(Cymbidium goeringii×Cymbidium ‘Han Xiang Mei’)为材料,MS+琼脂4 g·L-1+蔗糖20 g·L-1+椰汁100 mL·L-1为基础培养基,通过单因素试验,探讨细胞分裂素(TDZ/6-BA)和无机盐浓度(P、K)对其试管花诱导的影响,测定花芽诱导的蛋白质、可溶性总糖含量与超氧化物歧化酶(SOD)活性及激素水平(IAA、ABA)。结果表明,添加0.2 mg·L-1 TDZ和2 mg·L-1 6-BA的花芽诱导率最高,分别为14.33%和14.00%;无机盐浓度3P/3K和3P/5K的培养基花芽诱导率较高,分别达16.67%和11.33%;花芽诱导最佳培养基为MS(3P, 3K)+TDZ 0.2 mg·L-1+椰汁100 mL·L-1+琼脂 4 g·L-1+蔗糖20 g·L-1,花芽诱导率可达34%左右。生理生化指标检测显示,可溶性蛋白、可溶性总糖含量及SOD活性与花芽诱导率呈正相关;稳定的内源激素IAA和ABA含量对花芽诱导有一定的积极作用,含量过高对花芽诱导有抑制作用。     

发酵液预处理和树脂交链度等对L-赖氨酸吸附的影响

用絮凝技术预处理L-赖氨酸发酵液,不仅大大提高了发酵液的固液分离效果并使树脂对L-赖氨酸的重量吸附容量增加了25%。提高树脂的交链度(DVB=10%)既可使吸色率降低19%左右又可使其对L-赖氨酸的体积交换容量上升5%,树脂对L-赖氨酸的吸附特性还表现在上柱液中其浓度为4%处有一极值点,此值比生产上所用浓度时的体交量增加约20%,综合效果为提高L-赖氨酸回收率达15%左右,经济效益显著。     

化妆品中的甲硝唑、氧氟沙星与环丙沙星HPLC检测法

目的:建立反相高效液相色谱同时测定化妆品中的甲硝唑、氧氟沙星与环丙沙星方法.方法:以十八炕基硅烷键合硅胶为填充剂,以0.01mol/L四丁基溴化铵溶液(三乙胺调pH至3.0)-甲醇(88:12)为流动相,柱温30℃,流速1.0ml/min.315nm、293nm、277 nm分别作为甲硝唑、氧氟沙星、环丙沙星含量测定的检测波长.样品先用乙腈-水(0.1%甲酸)(体积比5:95)溶液提取,经正己烷脱脂后测定.结果:甲硝唑在2.02～50.59μg/ml,氧氟沙星在2.03～50.69μ g/ml,环丙沙星在2.02～50.45μg/ml范围内与峰面积线性关系良好,r分别为0.9999,0.9998和0.9999.10,25,40μ/g/ml三个浓度水平甲硝唑、氧氟沙星和环丙沙星的平均回收率为85.88%～97.20%,RSD为1.11%～6.10%;检测限均为1ng.结论:本法快速、准确、可用于化妆品中擅自添加的甲硝唑、氧氟沙星与环丙沙星的筛查及含量测定.     

基于稳健性设计优化L-赖氨酸发酵过程

目的:选择发酵系统中各可控因素的最佳水平组合,从而减少各种干扰的影响,以获得稳健的赖氨酸产量。方法:利用田口法的内外表与Box性能规则优化赖氨酸发酵条件。结果:通过实验得知,转速、硫酸铵和葡萄糖浓度对发酵影响较大;结果稳定的最优发酵条件为初始葡萄糖浓度为80g/L、硫酸铵浓度为42g/L、转速为225r/min、初始pH值为6.7、接种量为8%。经实验验证,最优化发酵条件是低灵敏度的,最优目标值比较稳健。在10L自动发酵罐上培养65h,L-赖氨酸盐酸盐的产量为165.68g/L,比优化前提高了12.4%。结论:基于稳健性设计所得的最优发酵条件参数,可使目的产物产量稳定,便于生产操作。     

生物基塑料单体5-氨基戊酸的生物合成新途径

5-氨基戊酸(5-aminovalanoic acid,5AVA)可作为新型塑料尼龙5和尼龙56的前体,是合成聚酰亚胺的有前途的平台化合物。目前5-氨基戊酸的生物合成法普遍产率较低且合成过程复杂,成本高。为实现5AVA的绿色生物合成,本研究通过组合表达来自日本白腹鲭(Scomber japonicas)的L-赖氨酸α-氧化酶、来自乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)的α-酮酸脱羧酶和来自大肠杆菌(Escherichia coli)的醛脱氢酶,在大肠杆菌中建立了一条以L-赖氨酸为原料,以2-酮-6-氨基己酸盐为中间产物生物合成5AVA的途径。在葡萄糖浓度为55 g/L,赖氨酸盐酸盐40 g/L的初始条件下,最终消耗158 g/L的葡萄糖和144 g/L的赖氨酸盐酸盐,补料分批发酵产生了57.52 g/L的5AVA,摩尔得率为0.62 mol/mol。与文献报道的以2-酮-6-氨基己酸盐为中间产物的5AVA生物合成途径相比,本文报道的新途径无需使用乙醇和双氧水,且5AVA产量进一步提高。     

盐酸沙拉沙星在鲫体内的残留及消除规律研究

采用高效液相色谱法测定鲫组织中沙拉沙星并初步研究了盐酸沙拉沙星在鲫组织中的残留及消除规律。在21±2℃下,以20mg/kg的剂量单次口灌给药,取血浆和肌肉、皮肤、肝胰脏、肾脏、卵巢5种组织,各样品中加入甲磺酸达氟沙星作内标,用二氯甲烷提取组织中的药物,正己烷去脂,反相高效液相色谱法测定其中盐酸沙拉沙星的浓度。此方法平均回收率均大于82.97%,日间变异系数小于8.41%,最低检测限可达0.0125μg/g。研究结果表明盐酸沙拉沙星在血浆和5种组织中消除速率快慢不一,肾脏为盐酸沙拉沙星残留的靶组织。若规定可食用组织中的盐酸沙拉沙星在最大残留限量为30μg/kg,由休药期(WDT)公式可得出盐酸沙拉沙星在鲫体内的WDT为14d。       

高含量赖氨酸酵母的选育和培养条件的研究

本文报道一株能积累赖氨酸的酿酒酵母S1为原始菌株,经10^-3mol/L的s-(β-氨基乙基)L-半胱氨酸(SAEC)处理,选得SAEC抗性突变株。再经二次紫外诱变,选得7株SAECr突变株,其中3株具有较高积累赖氨酸能力,并对其培养条件进行了研究。突变株MSU1的游离赖氨酸含量为菌体干重的7.83%,而突变株MSU5平均赖氨酸含量可达8.91%。     

HPLC-MS/MS法快速测定人血浆中美利曲辛及生物等效性研究

目的:建立测定人血浆中关利曲辛浓度的高效液相串联质谱法(HPLC-MS/MS),用于氟哌噻吨美利曲辛片的生物等效性研究.方法:以Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18(4.6mm× 150mm,5μm)为色谱柱,流动相为乙腈(含1%甲酸):0.02mo·L-1甲酸铵水溶液(80∶20,V∶),流速:0.8mL·min-1;柱温:40℃,以醋酸乙酯:二氯甲烷(4∶1,V∶V)为提取剂.样品经电喷雾离子源正离子化后,通过三重四级杆串联质谱仪,采用选择反应监测(SRM)对美利曲辛(m/z 292.2→232.2)和阿米替林(m/z 278.1-91.0)进行测定.结果:美利曲辛的高(50μg·L-1)、中(20μg·L-1)、低(0.5μg·L-1)3个浓度的平均回收率分别为97.53%、104.03%和106.87%,日内(n=5)、日间(n=3)RSD均小于15%;分析方法的最低定量限为0.2μg·L-1.线性范围为:0.2～60μg·L-1,回归方程为:F=1.8691ρ+0.0555,r=0.9986(n=9),权重为1/ρ2.结论:该方法灵敏、准确、简单、快速,可用于临床血浓监测和药动学研究.