多拷贝毕赤酵母重组菌表达GCL摇瓶优化和高密度发酵

目的:构建高效表达白地霉脂肪酶的毕赤酵母重组菌株,并对筛选得到的菌株进行摇瓶发酵条件优化和分批补料高密度发酵工艺研究。方法:将诱导型表达载体pPIC9K-gcl电转化至毕赤酵母GS115。通过橄榄油-罗丹明B平板和摇瓶发酵筛选高脂肪酶活力的重组菌株,运用基于TaqMan探针的实时荧光定量PCR 法确定其拷贝数,并对菌株进行摇瓶发酵条件优化。在此基础上,研究重组菌在3L 发酵罐中的高密度发酵工艺。结果:筛选得到一株具有3 个白地霉脂肪酶基因拷贝的菌株GS115/pPIC9K-gcl 78#,初始酶活力为220 U/ml。当摇瓶发酵条件为甲醇诱导96 h,每24 h甲醇添加量1 %,接种量2 %,培养基初始pH 7.0,500 ml摇瓶装液量50 ml,甲醇诱导温度25℃ 时酶活力达735 U/ml。3L 发酵罐高密度发酵176.5 h,酶活力达到3360 U/ml,总蛋白含量达到4.30 g/L,且发酵过程中细胞活性一直保持在96 % 以上。结论:基因拷贝数与重组菌株的产酶水平呈正相关,摇瓶优化可显著提高重组菌株的产酶能力,为白地霉脂肪酶的工业化生产奠定了技术基础。     

环境条件及摇瓶补糖策略对谷胱甘肽发酵的影响

研究了酵母摇瓶发酵中pH、装液量、初糖浓度、碳氮磷比和补糖方式对谷胱甘肽(GSH)发酵的影响。结果表明,GSH发酵适宜的初始pH和装液量分别为6 0和500ml锥形瓶内装液量60m1。初糖浓度对GSH发酵有较大的影响,超过12g／l,的初糖浓度将减少胞内GSH含量。应用计算得出的一种以控制比生长速率为目的的摇瓶补糖策略,在总糖浓度为26．2g／L下发酵12h,最终细胞浓度和胞内GSH含量分别达到8.78g／L和13．6mg／g,发酵液内GSH总量达到119．4mg／L,细胞对糖产率达到0.335g／g。     

暹罗芽孢杆菌高产γ-聚谷氨酸的发酵条件优化

【背景】γ-聚谷氨酸（poly-γ-glutamic acid,γ-PGA）产生菌多为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）、地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）等,而暹罗芽孢杆菌（Bacillus siamensis）相关研究较少。【目的】研究暹罗芽孢杆菌产γ-PGA的液体发酵条件。【方法】以自行分离的暹罗芽孢杆菌CAU83为出发菌株进行液体发酵,通过单因素试验和正交试验法研究了碳氮源、前体物质、发酵温度及pH对菌株生产γ-PGA的影响。【结果】经摇瓶优化,γ-PGA的最适碳源、氮源和前体物质分别为乳糖30g/L、酵母提取物5g/L和L-谷氨酸钠60 g/L,最适培养条件为发酵温度37℃和pH 7.0,γ-PGA产量由8.4 g/L提升至30.1 g/L,比优化前提高了260%。经分批补料发酵,60 h时γ-PGA产量最高为59.5 g/L,比摇瓶提高了98%,产率为0.99 g/（L·h）。所产γ-PGA分子量为3.8×10⁶ Da,聚合度较高。【结论】...     

L-缬氨酸高产菌株的选育研究

以产L-缬氨酸的谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)为原始菌株,利用注入低能氮离子束进行一系列诱变,获得一株稳定的高产L-缬氨酸突变菌株。摇瓶培养96h后发酵能力可达38.0g·L-1,较出发菌株提高18.01%。通过对摇瓶中葡萄糖、玉米浆浓度及培养条件进行优化,发酵能力达到40.6g·L-1,50L发酵罐的发酵能力可达70g·L-1左右。     

一株产生L-乳酸的米根霉

为获得理想的L-乳酸产生菌,选择适合根霉属微生物生长的土样,利用溴甲酚绿平板结合摇瓶复筛的方法得到了一株有一定L-乳酸积累能力的米根霉Rhizopus oryzae CS323。摇瓶发酵试验显示,在未优化发酵条件的情况下发酵48h,米根霉CS323L-乳酸积累量达到50.1g/L,是一株有良好改造潜力的L-乳酸产生菌,适合作为进一步诱变育种的出发菌株。     

脯氨酸-4-羟化酶在大肠杆菌中的密码子优化表达及对反式-4-羟脯氨酸生物合成的作用

为了使脯氨酸-4-羟化酶基因在重组大肠杆菌中得到高表达,通过调整大肠杆菌密码子偏好性以及mRNA二级结构,使得脯氨酸-4-羟化酶基因得到优化。将优化后的脯氨酸-4-羟化酶基因插入含有色氨酸串联启动子的p UC19质粒,构建重组质粒p UC19-ptrp2-Hyp,并导入大肠杆菌BL21(DE3)中。在摇瓶水平,重组菌以L-脯氨酸为底物发酵8 h,可积累(0.492±0.034)g/L的反式-4-羟脯氨酸。在发酵罐水平,通过补料分批发酵来提高反式-4-羟脯氨酸的产量,当补糖速率为18 g/h时,反式-4-羟脯氨酸的产量高达42.5 g/L,反式-4-羟脯氨酸产率为0.966 g/(L·h)。     

L-谷氨酰胺高产菌的选育和发酵条件

以嗜乙酰乙酸棒杆菌(Corynebacterium acetoacidophilum)LG-3为出发菌株,经紫外线(UV)和硫酸二乙酯(DES)诱变处理,磺胺胍(SG)、高浓度(NH4)2SO4定向筛选,获得1株谷氨酰胺高产菌株LG-65,在未经优化的条件下摇瓶发酵72 h可产谷氨酰胺43.5 g/L,比出发菌株的产量32.4 g/L提高了34.3%.在此基础上,对其发酵条件进行优化,经72 h摇瓶发酵产量可达47～48 g/L,7 L发酵罐补料分批发酵40 h可达55 g/L.     

缺陷短波单胞菌高产L-脯氨酸菌株的选育及其发酵条件优化

以缺陷短波单胞菌(Brevundimonas diminuta)JNPP-1为出发菌株,利用紫外诱变及亚硝基胍复合诱变的方式,获得1株遗传性能稳定、可抗磺胺胍、能耐高渗透压以及能以琥珀酸钠为唯一C源的、在培养基上有生长优势的L-脯氨酸高产菌株JNPP-NSS(SGr、Sucg、NaClr)。经发酵条件优化后,L-脯氨酸的最高质量浓度可达47.3 g/L,与出发菌株相比提高了45.1%,生产速率由0.45 g/(L·h)提高到0.78 g/(L·h)。     

L-缬氨酸产生菌的选育及其发酵培养基的优化

以黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)NJ-237为出发菌株,通过梯度传代适应性培养及同浓度药物平板富集培养的方式,逐步提高菌体的抗药物性能,获得了1株耐高糖和耐高浓度α-氨基丁酸(-αAB)的菌株NJ-2372。在单因素实验的基础上,利用响应面分析法对影响该菌株L-缬氨酸(L-Val)产量的3个重要因素玉米浆、生物素(VH)、硫胺素(VB1)的添加量进行优化。结果表明:当玉米浆、VH、VB1最佳添加量分别为11 g/L、35μg/L和101μg/L时,摇瓶发酵72 h,L-Val摇瓶发酵产量达到52.9 g/L。     

重组大肠杆菌的高密度发酵和甘油生产条件的初步研究

在摇瓶中进行重组大肠杆菌菌株BL21高密度发酵条件的研究,考察了葡萄糖浓度、盐离子浓度、温度、接种量、发酵时间等对该菌株生产甘油的影响。初步确定底物浓度为2.5%,盐离子浓度0.2%,温度为37℃,接种量为2%,经24h的摇瓶发酵,甘油产量最高达6.8g/L。在30L发酵罐实验中、按初步确定的优化条件发酵26h,甘油产量可达46.67g/L,是LB/葡萄糖培养基中甘油产量的2.06倍。     

L-蛋氨酸及甲醇浓度对毕赤酵母摇瓶发酵生产S-腺苷蛋氨酸的影响

利用甲醇传感器及高效液相色谱检测毕赤酵母摇瓶发酵过程的甲醇浓度及S-腺苷蛋氨酸(SAM)浓度,发现L-蛋氨酸浓度及甲醇浓度对毕赤酵母细胞生长及合成S-腺苷蛋氨酸具有影响,据此对摇瓶发酵过程的L-蛋氨酸浓度及甲醇浓度进行优化。优化结果表明:当L-蛋氨酸浓度为7.5 g/L时,最适于SAM积累,产量达到0.83 g/L;进而利用甲醇传感器对发酵过程的甲醇浓度进行检测及控制,考察不同甲醇浓度对SAM产量的影响,毕赤酵母产SAM的最佳甲醇浓度为15 g/L,在此浓度下SAM的产量达到1.41 g/L,比对照实验增加了21%。     

海藻酸钙固定赤霉菌菌丝产素的研究

将赤霉菌丝固定在海藻酸钙微球中进行连续发酵,考察产赤霉素情况。对海藻酸钠和钙盐浓度固定赤霉菌菌丝的微球稳定性进行初步研究,讨论了固定不同菌龄的赤霉菌微球在不同葡萄糖浓度下的产素能力及菌丝生长能力。实验表明:菌丝微球较稳定的固定条件是菌丝8 g/L、海藻酸钠浓度3 g/L和钙离子浓度3 mol/L;摇瓶发酵72 h,90 h的菌丝微球中菌丝营养生长基本停止,当培养液葡萄糖浓度为2 g/L时,赤霉素终浓度为1 145.5 μg/ml,比生产速率为4.61×10^-3/h;在该条件下固定菌丝球的床层式连续发酵,赤霉素比生产速率为4.82×10^-3/h,是相应分批发酵过程中最大赤霉素生产速率的1.87倍。     

营养条件对兽疫链球菌发酵生产透明质酸的影响

透明质酸 (Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃａｃｉｄ ,简称ＨＡ)是Ｎ 乙酰氨基葡萄糖胺和葡萄糖醛酸以 β 1 3糖苷键和 β 1 4糖苷键连接而成的二糖单体重复构建而成的杂多糖 ,广泛存在于高等动物的结缔组织内。由于结构上的特点 ,ＨＡ具有很高的粘弹性和极强的保水性等特征 ,已被大量用于医学医药、化妆品工业[1,2 ] 。1937年Ｋｅｎｄａｌｌ[3 ] 等发现用溶血性链球菌 (Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ)可以产生ＨＡ。其后 ,陆续发现许多能产生ＨＡ的微生物菌种 ,逐渐开发出一条可替代传统的动物组织提取法[4 ] 生产ＨＡ的新途径…     

吸水链霉菌发酵生产谷氨酰胺转胺酶的补料研究

在吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)分批发酵研究的基础上,通过在菌体生长阶段指数流加葡萄糖,进行高细胞密度培养,获得了较高的菌体量;待菌体生长进入产酶期后,通过补加氮源,为产酶提供充足的氮源,其中通过流加蛋白质氮源,可以减少蛋白酶对成熟MTG的分解,促进产酶。结果表明,8~16 h采用较高的的比生长速率(0.15 h-1),后期降低比生长速率(0.10 h-1),此时得到的菌体量较高,可达到36 g/L,比分批发酵下的菌体量提高了80%。同时在培养基中添加50g/L的豆饼粉,最终酶活可达到5.79U/ml,提高了83%。     

调控pH提高分批发酵赤霉素GA3产量

为高效率发酵生产GA₃,对藤仓赤霉菌发酵过程pH进行优化调控研究。采用5L全自动发酵罐,在pH 3.0-5.0条件下,对藤仓赤霉菌菌丝生长及GA₃产量的影响进行了考察,实验数据表明：在pH 4.0条件下,菌比生长速率可获最大值,为0.395/h;而pH 3.0条件下,GA₃比生成速率最大,达到4.43mg/(g?h)。基于不同pH条件下,对菌比生长速率、得率、GA₃比生成速率的影响,提出GA₃分批发酵过程中的pH调控策略,即：0-20h,pH自然;20-50h,pH 4.0;50-80h,pH 3.0-3.5;80h后控制pH为3.5-4.0。在此控制模式下,经过196h发酵GA₃的终产量达到2 224mg/L,GA₃产率44.5mg/g,GA₃生产强度0.242mg/(L?h),分别比不控制pH条件下发酵的数值增长了7.75%、7.74%、8.04%,表明该pH控制策略能增进GA₃发酵生产效率。     

流加发酵对重组Bacillus subtilis发酵生产角质酶的影响

为实现基因工程菌Bacillus subtilis WSHB06-07生产角质酶的高产,在3L发酵罐中考察了不同初糖浓度对菌体生长和产酶的影响,并在选择38 g/L初始蔗糖浓度的基础上,进行碳源的分批流加和恒速流加,结果表明发酵16 h开始流加碳源,采用总补糖量60g/L,蔗糖平均流速为4g/(L·h)的恒速补料方式,角质酶酶活在31h可达到最大545.87U/ml,比分批发酵酶活提高67.8%,并获得较高的角质酶生产强度,满足工业化生产要求。     

Study of mycelial growth and bioactive polysaccharide production in batch and fed-batch culture of Grifola frondosa

The fermentation of Grifola frondosa was investigated in the shake flasks and a 5-L jar fermenter in batch and fed-batch modes. In the shake-flask experiments, the preferable mycelial growth and exopolysaccharide (EPS) production was observed at relatively low pH; maltose and glucose were preferred carbon sources for high mycelial production. The EPS was doubled after 13 d of cultivation when glucose was increased from 2% to 4%. Yeast extract (YE) (0.4%) in combination with corn steep powder (CSP) (0.6%) and YE (0.8%) in combination with CSP (1.2%) were preferred nitrogen sources for high mycelial production and EPS production, respectively. All plant oils tested significantly stimulate cell growth of G. frondosa but they failed to enhance EPS production. The EPS products usually consisted of two fractions of different molecular sizes varied by the plant oils used. The fed-batch fermentation by glucose feeding was performed when the glucose concentration in the medium was lower than 0.5% (5g/L), which greatly enhanced the accumulation of mycelial biomass and EPS; the mycelial biomass and EPS were 3.97g/L and 1.04g/L before glucose feeding, which reached 8.23g/L and 3.88g/L at 13 d of cultivation. In contrast, the mycelial biomass and EPS in the batch fermentation were 6.7g/L and 3.3g/L at 13 d of cultivation.     

重组巴氏毕赤酵母高密度发酵表达rHSA

对基因工程菌Pichiapastoris的摇瓶发酵条件进行了试验 ,并根据摇瓶发酵的优化结果进行了补料分批高密度发酵。在摇瓶发酵时 ,甲醇诱导基因工程菌P .pastoris表达重组人血清白蛋白的发酵周期为 96h ;甲醇的最佳诱导浓度为 1 0g L ;发酵pH范围为 5 72～ 6 5 9;在摇瓶培养时 ,随着接种量的增加 ,虽然目的蛋白表达量缓慢增加 ,但单位细胞光密度的蛋白产率却明显下降 ,符合y =1 2 941x- 0 50 59方程 (线性相关系数r=0 9789) ,其限制性因子很可能为溶氧。在分批发酵 ,接种量为 1 0 %且种子细胞光密度 (OD60 0 )为 2 0左右时 ,细胞生长的延迟期为 2 1 1h左右 ,细胞生长光密度与培养时间的关系模型为 :y =0 7841e0 .2 3 19t(线性相关系数r=0 .993 6 ) ;在补料发酵时细胞干重浓度可达到 1 1 5g L— 1 6 0g L ,在 1 2 0h重组人血清白蛋白表达量最大达到 3 6g L。     

代谢工程改造大肠杆菌合成己二酸

己二酸是一种具有重要应用价值的二元羧酸,是合成尼龙-66的关键前体。目前,生物法生产己二酸存在生产周期长、生产效率低的问题。本研究选择一株野生型高产琥珀酸菌株大肠杆菌(Escherichia coli) FMME N-2为底盘细胞,首先通过引入逆己二酸降解途径的关键酶,成功构建了可合成0.34 g/L己二酸的E. coli JL00菌株;接着,对合成路径限速酶进行表达优化,使E. coli JL01菌株在摇瓶发酵条件下产量达到0.87 g/L;随后,通过敲除sucD基因、过表达acs基因和突变lpd基因的组合策略平衡己二酸合成前体的供应,优化菌株E. coli JL12己二酸产量进一步提升至1.51 g/L;最后,在5 L发酵罐上对己二酸发酵工艺进行优化。工程菌株经72 h分批补料发酵,己二酸的产量达到22.3 g/L,转化率为0.25 g/g,生产强度为0.31 g/(L·h),具备了一定的应用潜力。本研究可为包括己二酸在内的多种二元羧酸细胞工厂的构建提供理论依据和技术基础。