立枯丝核菌可溶性蛋白图谱研究 Ⅱ.用等电聚焦电泳比较各融合群及亚群

利用薄层(0.5mm)聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳对于pH3.5-10.0范围内立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)AG-1～AG-5各融合群及亚群共45个参试菌株的菌体可溶性蛋白进行了比较分析。参试菌株分别来自于日本、美国及国内鉴定的菌株。电泳结果表明:不同融合群或亚群的蛋白质图谱表现显著差异。AG-3、AG-4、A G-5各融合群和AG-1IA、IB,IC、AG-2-1、AG-2-2各亚群分别表现出各自的特征性图谱。以上结论与前篇(刘力、葛起新,1988)报道中的基本相符,且更为明确。针对试验结果,就可溶性蛋白等电聚焦电泳图谱与培养性状类型的比较以及不同菌培养时间对电泳结果的影响进行了分析讨论。     

利用同功酶分析丝核菌菌丝融合1群lA亚群(Rhizoctonia solani AG1-lA)的遗传多样性

利用系统聚类分析方法,通过对丝核菌菌丝融合一群Rhizoctonia solani (AG-1)的23个菌株在七个同功酶电泳所显示的50个表现型进行了遗传分析。结果显示,23个丝核菌菌株可聚类为三大类,他们分别代表了丝核菌菌丝融合一群中的三个亚群AG-I A,AG-IB,AG—IC;其中第一聚类又可进一步分为四个亚类。同功酶的分析证实了丝核菌菌丝融合1群中的三个亚群的分类概念是具有遗传背景的,并可作为丝核菌菌丝融合群之间及群内分类的重要手段。     

新疆北疆棉田立枯丝核菌菌丝融合群及其营养亲和群研究

从新疆北疆棉区采集了典型的棉花立枯病病苗及棉田土标样686份,按常规分离方法分离得到399个分离物,从中鉴定出272个纯化的立枯丝核菌(Rhizotonia solaniKühn)菌株,经玻片吉姆萨氏染剂(Gimsa′sstain)染色程序观察细胞核数目,全部测试菌株均属于多核。用标准菌株,通过载玻片菌丝融合实验测定,将纯化的272个菌株划归为3个菌丝融合群:AG-2、AG-4和AG-5,分别占总菌株的6.24%、84.2%和1.1%。另有23个菌株不与任何标准菌株融合,占8.46%,说明新疆北疆棉田立枯丝核菌的优势菌系是多核丝核菌的AG-4融合群。通过从10种不同配方的培养基中筛选的效果好的麦芽蛋白胨(MPDA)配方培养基(Ⅱ)进行对峙培养,以建立标准菌株,将纯化获得的272个丝核菌菌株,划分为6个不同的营养亲和群,研究说明新疆北疆地区棉田立枯丝核菌各菌丝融合群内确有不同程度的分化。     

黄淮海地区夏玉米纹枯病菌的融合群鉴定

从黄淮海地区采集玉米纹枯病标样250余份,分离得到176个丝核菌菌株。融合群测定及5.8SrDNA-ITS区序列分析结果表明,这些菌株分别属于多核丝核菌的AG1-IA、AG1-IB、AG4-HG-I、AG-5、WAG-Z融合群及双核丝核菌的AG-A、AG-Ba融合群。其中AG1-IA是优势融合群,占分离菌株总数的64.20%,其次是AG-Ba,占12.50%,再依次分别是WAG-Z(10.23%)、AGI-IB(5.11%)、AG-4-HG-I(3.98%)、AG-5(2.27%)和AG-A(1.70%)。其中AG-Ba融合群是国内首次在玉米上分离得到。从各融合群中选取代表性的菌株进行5.8S rDNA-ITS区序列分析结果表明,隶属不同融合群或亚群的菌株其5.8S rDNA-ITS区序列存在较大的差异,而相同融合群(或亚群)不同菌株之间其序列的一致性可高达97%-100%。     

江苏大麦纹枯病菌酯酶同工酶的测定

对立枯丝核菌(Rhizoctonia solani giihn)和禾谷丝核菌(R．E erealis Vande r Hoeven)的16个菌丝融合群或亚群的标准菌株及来自}工苏大麦纹枯病的9个菌丝融合群或亚群共68个菌株进行了聚丙烯酰胺凝胶电泳,测定酯酶同工酶。结果表明：1．立枯丝核菌主酶带数的变幅范围比禾谷丝核菌大;2．无论禾谷丝核菌,还是立枯丝核菌,各菌丝融合群或亚群之间的电泳图谱都有显著差异,但与各自对应的融合群或亚群的标准菌株的图谱则相似;3．44个大麦禾谷丝核菌CAG一1群菌株间的图谱也有差异,但都有一条共同的主酶带(E．);4．据主副酶带数目和位置,将禾谷丝核菌CAG一1群菌株再分为2个类型(1型和II型)和5个亚型(1a、Ib、Ic和Iia、Iib);酶谱类型与菌株的采集品种和致病性无关,但与采集地点似有一定的联系。     

山东省玉米纹枯菌融合群类型及遗传多样性

从山东省14个县市区采集的玉米纹枯病标本上分离获得103个玉米纹枯菌菌株。核荧光染色确定菌丝细胞核的数目,以及利用配对培养法确定不同菌株细胞是否融合。结果表明这些菌株分别属于多核丝核菌的AG-1-IA、AG-1-IB、AG-1-IC、AG-3、AG-4-HG-I、AG-5和WAG-Z融合群和双核丝核菌的AG-Ba融合群,其中AG-1-IA类型菌株数量占菌株总数的60.19%,为优势融合群。通过inter-simple sequence repeats（ISSR）标记技术进行菌株的遗传多样性分析,获得45个ISSR分子标记,其中91.1%的片段具有多态性,表明种群间存在丰富的遗传多样性。UPGMA聚类分析将103个菌株分成6个遗传聚类群,遗传聚类群的菌株组成说明遗传群组的划分与菌株的地理来源和菌株融合群类型均存在一定的相关性。     

立枯丝核菌蛋白质电泳图谱研究 Ⅰ.融合群与图谱的相关性

用来自日本和美国的立枯丝核菌8个融合群11个类群代表菌株进行可溶性蛋白质电泳,其结果表明,各融合群及亚群之间电泳图谱有显著差异,而同一类群菌株的电泳图谱则相似。分析来源于华东等地已鉴定的融合类群117个菌株的电泳图谱显示,同一融合群内菌株,虽然采集地区、寄主植物或致病力不同,其蛋白质图谱仍十分相似;而不同融合类群的菌株,即使在同一田块中同一种寄主植物上引起相似病害,其图谱也显示出明显差异。本文就上述可溶性蛋白质图谱显示的结果与其它研究者在血清学、DNA同源性.酯酶等生化水平上对融合群的研究结果进行了比较和探讨。     

立枯丝核菌蛋白质电泳图谱研究I．融合群与图谱的相关性*

用来自日本和美国的立枯丝核菌8个融合群11个类群代表菌株进行可溶性蛋白质电泳,其结果表明,各融合群及亚群之间电泳图谱有显著差异,而同一类群菌株的电泳图谱则相似。分析来源于华东等地已鉴定的融合类群117个菌株的电泳图谱显示,同一融合群内菌株,虽然采集地区、寄主植物或致病力不同,其蛋白质图谱仍十分相似;而不同融合类群的菌株,即使在同一田块中同一种寄主植物上引起相似病害,其图谱也显示出明显差异。本文就上述可溶性蛋白质图谱显示的结果与其它研究者在血清学、DNA同源性．酯酶等生化水平上对融合群的研究结果进行了比较和探讨。     

中国东北地区玉米纹枯病菌的融合群鉴定

自东北三省采集玉米纹枯病标本300余份,分离获得286个丝核菌菌株。融合群测定及5.8S rDNA-ITS区序列分析结果表明,这些菌株分别属于多核丝核菌的AG1-IA、AG1-IB、AG1-IC、AG4-HG-I、AG4-HG-III、AG-5、WAG-Z群及双核丝核菌的AG-Ba群。其中AG1-IA是优势致病群,占分离菌株总数的38.46%,其次是WAG-Z和AG-5群,分别占26.92%及24.83%。AG4-HG-III群菌株是国内首次从罹病玉米植株上分离得到。自各融合群中选取代表性的菌株进行5.8     

志贺氏菌属鲍氏(S. boydii)亚群基因组组成与进化分析

利用比较基因组杂交法(comparative genomic hybridization, CGH)对志贺氏菌属鲍氏(S. boydii)亚群共18个血清型代表菌株的基因组结构组成进行比较分析, 结果显示, 该亚群基因组的“共有骨架”包含2552个与非致病性大肠杆菌K12同源的ORFs. 比对K12基因组, 该亚群所有菌株基因组共同缺失ORFs为199个, 主要涉及外膜蛋白编码基因和O-抗原合成相关基因, 而属于亚群特异性的ORFs主要以噬菌体基因和未知功能ORFs为主, 一些参与铁离子代 谢、运输和Ⅱ型分泌系统基因在大多数的鲍氏菌株中存在. 以比较基因组杂交法得到的进化分析显示: 鲍氏亚群18个血清型代表菌株可分为4组, 其中13型与其他菌株有较大的差异. 这种分组结果与某些代谢相关的基因分布情况存在对应关系. 通过对该亚群“共有骨架”、缺失基因和株特异基因, 以及进化分类等方面的分析, 以期探索该亚群基因组的进化规律, 并为志贺氏菌属鲍氏亚群的致病机理、疫苗研制和药物开发等方面的研究提供重要线索.     

苏云金芽胞杆菌营养期杀虫蛋白基因的克隆及表达分析

选择本实验室分离的苏云金芽胞杆菌李氏亚种 (subsp. Leesis) 菌株YBT833、鲇泽亚种(subsp.Aizawai) 菌株YBT-1416和库斯塔克亚种(subsp. Kurstaki)菌株YBT1535为出发菌株,以营养期杀虫蛋白基因PCR扩增的特异片段为探针,进行总DNA酶切片段的Southern杂交定位。结果显示3株菌株的营养期杀虫蛋白基因,均位于经XbaI完全消化的4～5kb大小的DNA 片段上。将该区域DNA片段回收后克隆到pUC19载体,建立了3个较基因组文库小的亚基因组文库。通过菌落原位杂交筛选和酶切鉴定分别得到3个相应的营养期杀虫蛋白基因vip83、vip14和vip15,并对其测序。DNA序列比较发现基因vip83与已知营养期杀虫蛋白基因存在5个差异碱基。将vip83、vip14基因亚克隆到苏云金芽胞杆菌大肠杆菌穿梭载体pHT315, 分别得到重组质粒pBMB8901和pBMB8902。将它们电转化到vip^-的B.t.受体菌BMB171和4Q7,获得了相应的工程菌BMB8901-171,BMB8902-171,BMB8901-4Q7和BMB8902-4Q7。SDS-PAGE电泳检测均有88kD大小的蛋白表达。生物测定结果亦表明了,营养期杀虫蛋白Vip83和Vip14对鳞翅目棉铃虫、小菜蛾和甜菜夜蛾的三龄幼虫均有一定的杀虫活性;其中对小菜蛾的毒力最高,LC₅₀值分别为28.6,31.6,45.4和37.6μL/mL。该结果为构建高效广谱工程菌提供了实际材料和理论依据。      

中国北方马铃薯黑痣病立枯丝核菌的融合群鉴定

从山东、甘肃、青海、内蒙古、河北和黑龙江6省采集马铃薯黑痣病标本300余份,分离获得251个立枯丝核菌Rhizoctonia solani菌株。融合群测定结果表明,这些菌株分别属于多核的丝核菌AG‐3、AG1‐IB、AG4‐HG‐Ⅰ、AG4‐HG‐Ⅱ、AG4‐HG‐Ⅲ、AG‐5和AG‐11融合群。其中AG‐3是优势致病群,占分离菌株总数的71.31%;其次是AG4‐HG‐Ⅰ,占15.14%;AG‐11融合群菌株是国内首次从罹病马铃薯植株上分离得到。从各融合群中选取代表性的菌株进行5.8S rDNA‐ITS区序列分析,结果表明,隶属不同融合群或亚群菌株的5.8S rDNA‐ITS区序列存在较大的差异,而相同融合群(亚群)不同菌株的序列具有较高一致性。     

尝试利用R-Q对应因子分析识别分群融合子代

在特定融合组合的子代群体中,以不同姊妹菌株作为观察样本(n=N),以蛋白质电泳全部谱带泳动率作为指标(p=P)。则所对应的谱带光密度扫描峰面积作为其观测值(x)(当某菌株缺乏某条带时,其峰面积记为零),利用R-Q对应因子分析程序,解析这个数据矩阵(X_nxp)。能够在同一标度的因子平面上考察这一特定融合重组事件发生后．姊妹菌株间和各菌株内蛋白质谱带位置与含量间以及它们相互之间的多重内在联系,从而推断子代群体与亲本的遗传继承关系。并由此来识别和分群姊妹菌株。这种探索具有拓展数值分类能力和指导融合育种实践的意义．     

根瘤菌可溶性蛋白和酯酶的电泳图谱分析

我们分析行了二十株根瘤菌可溶性蛋白和酯酶的电泳图谱。菌株中14株分离自野大豆的快生型大豆根瘤菌和3株慢生型大豆根瘤菌;另外3株根瘤菌分别分离于苜蓿、豌豆和三叶草。根据它们电泳谱带的Rf值,计算了各根瘤菌可溶性蛋白图谱间的相似性系数。快生型大豆根瘤菌的电泳图谱均不同于慢生型大豆根瘤菌和其他根瘤菌。鉴于各菌株有其独特图谱,以此作为根瘤菌分类和鉴定的依据,是较可靠的方法。     

海南快生根瘤菌蛋白、多位点酶及质粒电泳

在本室以前的研究中,海南快生根瘤菌具有分类上的多型性。其一部分归于已知各根瘤菌种,另有一部分菌株构成独立的表观群及相应的ＤＮＡ同源群（亚群Ⅱ和Ⅳ）。本文采用不同的电泳方法,分析了海南快生根瘤菌和已知根瘤菌种的代表共５５个菌株的全细胞蛋白、酯酶、过氧化物酶及质粒组成。结果表明：同一亚群的菌株间有相似的蛋白图谱,种群之间有较明显的差异,根瘤菌中普遍存在酯酶,酶带的数量和迁移率具有菌株专一性,更适合于苗株的鉴别。过氧化物酶只在部分菌株中观察到,亚群Ⅱ与亚群Ⅳ的菌株均显示一条酶带,但二者之间的相对迁移率有明显差别     

海南快生根瘤菌蛋白,多位点酶及质粒电泳

在本室以前的研究中,海南快生根瘤菌具有分类上的多型性。其一部分归于已知各根瘤菌种,另有一部分菌株构成独立的表观群及相应的ＤＮＡ同源群（亚群Ⅱ和Ⅳ）。本文采用不同的电泳方法,分析了海南快生根瘤菌和已知根瘤菌种的代表共５５个菌株的全细胞蛋白、酯酶、过氧化物酶及质粒组成。结果表明：同一亚群的菌株间有相似的蛋白图谱,种群之间有较明显的差异,根瘤菌中普遍存在酯酶,酶带的数量和迁移率具有菌株专一性,更适合于苗株的鉴别。过氧化物酶只在部分菌株中观察到,亚群Ⅱ与亚群Ⅳ的菌株均显示一条酶带,但二者之间的相对迁移率有明显差别。质粒电泳中,大多数海南快生菌中存在着大质粒,分子量范围是２０－４０００Ｋｂ,同一亚群中的不同菌株间具有一定相似性,这些结果为海南快生型根瘤菌的分类提供了一些辅助证据。     

康氏木霉C1酶的简捷提纯法及酶性质的研究

康氏木霉(Trichoderma Koningii)白色变异菌株AS 3．4001的粗酶制剂,经Sephadcx G-75凝胶过滤柱脱盐并除去大量杂蛋白,然后通过DEAE—scphadcx A一50离子交换层析,用0—0.5M Nacl梯度冼脱即得c。酶纯品。全程序仅需二天时间。 经聚丙烯酰胺凝胶电泳及SDS电泳鉴定均为单一带。此酶的分子量用SDS电泳及凝胶过滤法测定分别为58,000和5 2,000,用等电聚焦测其等电点为pH4 0。作用最适pH也为q o。此酶有较好的稳定性,在酸性pH(2 2)、碱性pH(8 0)及中性(水)中均能保持较长时间而不丧失活力。     

结肠癌蛋白质双向电泳技术的建立

目的:建立结肠癌13cm和24cm非线性分离系统的2-D图谱,分析比较两者的分辨率.方法:提取结肠癌总蛋白,用pH3-10非线性干胶条对样品进行等电聚焦分离,并分别使用13cm和24cm电泳系统进行双向电泳,考马斯亮蓝G250染色,图像分析,比较对比两组2-D图谱,量化分析两种系统的分辨率差异.结果:在等点电3-10,分子量20-170 kD范围内分别分离得到蛋白质斑点873个(13 cm电泳系统)和1349个(24cm电泳系统).对于24cm电泳系统,1 mg蛋白质上样量的电泳图谱清晰,分辨率较好.结论:成功建立了高分辨率、简便易控的结肠癌蛋白质组双向电泳技术平台.     

疫霉蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳

对北京,河北、青海、山东、湖北、广东等地不周寄主上收集的,属于 Phytophthoracapsici,P．Colocasiae,P．Heveac,P．Infestans, P．Melonis P．Nicotianac var. nicotianae 和 P．Nicotianae var. parasitica 7个种和变种的17株菌的蛋白质,进行了聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳的分析和比较,经多批次试验,7个种和变种各自恒定地呈现典型的蚤白质图谱,显示出种间的差异。其中 P. infestans 占11株,它们虽采自不同地区和寄主,又分属5个生理小种,经多次电泳,电泳图谱基本相同,但不同菌株存在一些差异。同一株菌,培养条件对电泳图谱影响不大,不论是培养在含苹果酸的培养基上,还是培养在延胡索酸培养基上,电泳图谱基本一致,只是电泳材料必须新鲜。     

天山根瘤菌（Rhizobium tianshanense）全细胞蛋白电泳和多位点酶电泳分析

用全细胞可溶性蛋白电泳和多位点酸电泳对１５株天山根瘤菌（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　ｔｉａｎｓｈａｎｅｎｓｅ）和其它１０株快慢生根瘤菌进行聚类分析,结果表明Ｒ．Ｔｉａｎｓｈａｎｅｎｓｅ种内菌株关系密切而与其它种不同。分析时将全细胞蛋白电泳图谱分为２５４等份,根据每等份内条带的有无进行聚类,结果与数值分类基本一致,说明用该方法对全细胞蛋白电泳结果进行聚类可以作为根瘤菌的分群手段;用所有出现的１０９种迁移率对１７种多位点酶的电泳结果作聚类分析,得到与全细胞蛋白电泳相似的结果。