表达重组别藻蓝蛋白质粒在工程菌株中的遗传稳定性研究

将含有表达重组别藻蓝蛋白基因的重组质粒pMal-2X的工程菌株P1分别在含有Amp的LB固体培养基上采用划线法连续传代至100代,其生长速度（在LB培养基中）、菌落形态和抗生素抗性等方面与原始种子库无明显差异;取第10,20,50,100代提取质粒DNA经EcoRI限制性内切酶酶切检查,酶切图谱没有改变。DNA测序未见apc基因变异。原代菌株与传代第10,20,50和100代菌株经诱导培养,其rAPC表达水平、菌体蛋白的SDS—PAGE图谱及重组蛋白的免疫原性均无明显差异。以上结果表明,重组质粒pMal-2X在工程菌株P1中具有良好的遗传稳定性。     

表达重组别藻蓝蛋白质粒在工程菌株中的遗传稳定性研究*

将含有表达重组别藻蓝蛋白基因的重组质粒pMal-2X的工程菌株P1分别在含有Amp的LB固体培养基上采用划线法连续传代至100代,其生长速度(在LB培养基中)、菌落形态和抗生素抗性等方面与原始种子库无明显差异;取第10,20,50,100代提取质粒DNA经EcoRⅠ限制性内切酶酶切检查,酶切图谱没有改变。DNA测序未见apc基因变异。原代菌株与传代第10,20,50和100代菌株经诱导培养,其rAPC表达水平、菌体蛋白的SDS-PAGE图谱及重组蛋白的免疫原性均无明显差异。以上结果表明,重组质粒pMal-     

蔷薇藻藻蓝蛋白的稳定性研究

蔷薇藻Rhodella reticulata是属于红藻门的一种海洋单细胞微藻,其生长过程中产生藻胆蛋白、胞外多糖等生物活性物质。蔷薇藻经过破碎,通过硫酸铵沉淀和DEAE Sepharose FF柱层析后,可以分离出较纯的藻蓝蛋白。本文从pH、温度、光照、食品添加剂、金属离子等方面对蔷薇藻藻蓝蛋白稳定性作了较全面的研究：藻蓝蛋白在pH为7时最稳定;低温有利于保持藻蓝蛋白的活性;相对于光照,在避光条件下,藻蓝蛋白有较高的稳定性;适当浓度的蔗糖和葡萄糖都有利于藻蓝蛋白的保存;金属离子影响藻蓝蛋白的稳定性。     

嗜热蓝藻优雅粘囊藻藻胆体的特性和别藻蓝蛋白的亚基组成

研究了优雅粘囊藻藻胆体的特性。从聚丙烯酰胺凝胶电泳、吸收光谱和二阶导数图谱可证明,它的ＰＢＳ含有一种红色藻胆蛋,两种Ｃ－藻蓝蛋白和三种别藻蓝蛋白。但是,用ＰＡＧＥ和羟基磷灰石柱层析分离和纯化所得藻胆蛋白,一般仅得到一种Ｃ－ＰＣ和一种亚基组成特殊的别藻蓝蛋白ＡＰＣ。这种ＡＰＣ吸收光谱和荧光发射相同于已报告的ＡＰＣ６６０ｎｍ。但是它的亚基组成是（αα＇ββ＇）２而不是（α＇α２β２β＇）Ｌｃ＾１０或α     

藻蓝蛋白和藻红蓝蛋白β亚基半胱氨酸的定点突变及体外重组研究

为研究藻蓝蛋白 (PC)和藻红蓝蛋白 (PEC) β亚基 (分别简称为 β PC、β PEC)生物合成、结构与功能的关系 ,用MegaprimerPCR定点突变技术设计 β PC、β PEC中与藻蓝胆素连接的第二个半胱氨酸的定点突变蛋白质 β PC(C15 5I)和 β PEC(C15 5I)。将相应的基因片段亚克隆于表达载体pET 30a,并转化大肠杆菌BL2l(DE3)。经IPTG诱导后 ,β PC(C15 5I)和 β PEC(C15 5I)在大肠杆菌中均得到了高效表达。β PC(C15 5I)和 β PEC(C15 5I)与藻蓝胆素的重组结果表明两个突变体的结构基本没发生改变 ,有利于对 β PC和 β PEC的生物合成进行进一步研究。     

层理鞭枝藻藻蓝蛋白和藻红蓝蛋白β亚基Cys-155的藻胆色素共价偶联

层理鞭枝藻(Mastigocladus laminosus PCC7603)藻蓝蛋白β-CPC和藻红蓝蛋白β-PEC中均存在2个藻胆色素结合位点(Cys-84和Cys-155),可与藻蓝胆素(简称PCB)发生共价偶联反应,已有研究证实编码基因为alr0617的裂合酶CpcS1是催化Cys-84与PCB共价偶联的裂合酶。在研究Cys-155与PCB共价偶联的过程中,通过BLAST软件同源性对比分析后,筛选出4个基因:cpcT1、cpcT2、cpcS1、cpcS2,其中基因cpcT1和cpcS2,利用分子克隆的技术,根据实验需要转到载体pCDFDuet上,通过DNA电泳和蛋白质电泳挑选出正确的克隆。此4个基因对应的质粒与在大肠杆菌内生成PCB必需的质粒pACYCDuet-ho1-pcyA,以及质粒pET-cpcB(C84S)或pET-pecB(C84A),共同转入大肠杆菌BL21(DE3)内,进行体内重组,得到各重组蛋白,经过亲和层析柱提纯并透析,过滤掉金属离子,纯化透析后的蛋白经过活性比较、蛋白质电泳以及锌染色、蛋白质变性等试验以及荧光和紫外吸收光谱等鉴定,通过与相应文献中PCB光谱的比对,确定编码基因为all5339的裂合酶CpcT1能高效地催化Cys-155与PCB共价偶联,而其余3个基因不能起到催化作用。由此,能催化脱辅基蛋白β-CPC和β-PEC的两个位点共价偶联PCB的裂合酶均被发现。实验对于研究藻胆蛋白的生物合成、光合作用捕光机理以及藻胆体的组装等有重要的意义。     

藻胆蛋白研究

藻胆蛋白是大量出现于红藻 (Ｒｈｏｄｏｐｈｙ ｔａ)、蓝绿藻 (Ｃｙａｎｏｐｈｙｔａ)和隐藻 (Ｃｒｙｐｔｏｐｈｙｔａ)中的捕光色素蛋白 ,主要包括藻红蛋白、藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白三种。藻胆蛋白把捕获的光能高效地传递给叶绿素 ,从而使海藻的光合作用得以发生[1] 。细菌、藻类和高等植物的光合作用的共同特征是具有很多“天线分子” ,这些“天线分子”吸收光能并通过非放射性过程将激发能传递到含有叶绿素的“反应中心” ,在红藻、蓝绿藻和隐藻中 ,藻胆蛋白就充当这种“天线分子”的角色。因此 ,最初的藻胆蛋白研究主要集中在探讨其光合作…     

不同pH条件下R-藻红蛋白和C-藻蓝蛋白荧光寿命的研究

采用自己研制的时间分辨毫微秒荧光谱仪对R-藻红蛋白(R-PE )和C-藻蓝蛋白(C-PC)进行了荧光寿命的测定和研究,并对能量传递过程进行了分析和讨论.测得R-PE的荧光寿命为3.1±0.1ns,C-PC的荧光寿命为1.3±0.1ns,且在pH5—pH9的范围内不变;当pH<5时,两者的荧光寿命都有变短的趋势.我们还测定了R-PE和C-PC混合溶液中R-PE的荧光寿命不变,而C-PC的荧光寿命变长,从而表明存在着R-PE向C-PC的辐射能量传递.     

念珠藻葛仙米藻蓝蛋白α与β亚基基因克隆、表达及其单体结构模拟

天然抗氧化剂对于清除人体内自由基、保障健康具有重要作用。藻蓝蛋白(phycocyanin, PC)是蓝藻等藻类细胞内的一类特殊色素蛋白,具捕获光能的功能。体外研究发现,藻蓝蛋白具有较显著的抗氧化、抑癌细胞增殖等生物活性。试验利用食源性的拟球状念珠藻葛仙米(Nostoc sphaeroides)的基因组DNA为材料,借助PCR扩增克隆葛仙米藻蓝蛋白两个重要亚基α与β基因,Ns-PC-α和Ns-PC-β。结果表明,葛仙米基因组中,Ns-PC-α和Ns-PC-β基因编码框长度分别为492 bp和522 bp;Ns-PC-α和Ns-PC-β基因以双顺反子形式存在,Ns-PC-α位于Ns-PC-β下游。Ns-PC-α和Ns-PC-β分别编码由163与173个氨基酸组成的蛋白。Ns-PC-α和Ns-PC-β亚基蛋白多肽链中共含有3个半胱氨酸残基(Ns-PC-α的第85位与Ns-PC-β中的第83位氨基酸残基和第154位氨基酸残基),很可能是藻蓝胆素的结合位点。原核表达显示Ns-PC-α和Ns-PC-β分子量为近18 kD,Ns-PC-α比Ns-PC-β略小,与预测结果一致。模拟其高级结构,发现Ns-PC-α和Ns-PC-β单亚基均含有7个α-螺旋,除N端α-螺旋外,其它几个α-螺旋进一步折叠形成疏水核心区;并且,Ns-PC-α和Ns-PC-β结构上能够较好吻合,形成一稳定而封闭的单体,弧度近2π/3。Ns-PC-α和Ns-PC-β组成的这种单体结构是其进一步建构圆盘状三聚体Ns-PC-(α/β) 3的重要基础。本研究结果为食源性念珠藻葛仙米藻蓝蛋白抗氧化功能的进一步应用提供了重要依据。     

嗜热蓝藻优雅粘囊藻藻胆体的特性和别藻蓝蛋白的亚基组成

研究了优雅粘囊藻藻胆体（ＰＢＳ）的特性。从聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＰＡＧＥ）、吸收光谱和二阶导数图谱可证明,它的ＰＢＳ含有一种红色藻胆蛋白,两种Ｃ－藻蓝蛋白和三种别藻蓝蛋白。但是,用ＰＡＧＥ和羟基磷灰石柱层析分离和纯化所得藻胆蛋白,一般仅得到一种Ｃ－ＰＣ和一种亚基组成特殊的别藻蓝蛋白ＡＰＣ。这种ＡＰＣ吸收光谱和荧光发射相同于已报告的ＡＦＣ６６０ｎｍ。但是它的亚基组成是（αα′ββ′）２而不是（α′α２β２β′）Ｌｃ１０或（αβ）３。     

条斑紫菜藻红、藻蓝蛋白α和β亚基基因序列测定及分析

为了获得江苏吕泗的条斑紫菜藻红蛋白α(Pea)和β(Peb)亚基、藻 蓝蛋白α(Pca)和β(Pcb)亚基基因的DNA序列,本文对其基因进行了克隆、 序列测定及分析.根据已发表的基因序列(DQ666487.1)设计引物,对提取自 条斑紫菜叶状体的DNA进行PCR和电泳鉴定,产物经测序证实获得藻红蛋白 序列1 357 bp (HM008263.1)和藻蓝蛋白序列1 335 bp (HM008262.1).上述 两段序列与已报道的条斑紫菜相关序列(DQ666487.1)同源性均为99％,与 其它几种紫菜相关序列同源性为88％～98％.两段序列均采用多顺反子转录 策略,排布顺序为5′Untranslated Regions(UTR)- Peb -间隔区- Pea -3 ′UTR 和 5′UTR- Pcb -间隔区- Pca -3′UTR.文中对基因翻译所得氨基 酸序列做了理化参数、功能位点及空间构型的预测.基于对序列开放阅读框 、启动子、Shine-Dalgarno (SD)序列的分析,本文对条斑紫菜分类地位进 行了讨论.     

柱孢鱼腥藻的藻蓝蛋白亚基和F_(678)色素蛋白

柱孢鱼腥藻的藻蓝蛋白包含有两个亚基。β亚基具有578nm吸收峰和600nm荧光发射峰,分子量19.80±0.40KD,可表明β亚基仅有一个载色团。α亚基具有578nm和630nm吸收峰及645nm的荧光发射峰,分子量17.35±0.38,α亚基可能有两个载色团。别藻蓝蛋白有635nm和650nm吸收蜂及664nm的荧光发射峰。具藻胆体的类囊体膜从高盐浓度缓冲液移至低盐浓度缓冲液时表现678nm荧光发射峰,可能柱孢鱼腥藻存在的F_(678)色素蛋白相当于GLazer(1975)的别藻蓝蛋白B。     

真空冷冻干燥后藻蓝蛋白提取工艺及稳定性的研究

为拓宽极大螺旋藻藻蓝蛋白的应用范围,研究了温度、时间、pH值、固液比对其提取工艺及金属离子、食品添加剂等因素对其稳定性的影响。结果表明：藻蓝蛋白的最佳提取工艺为温度30℃、反应时间15h、Na2HPO4-柠檬酸缓冲液pH值70,固液比1∶60,在此条件下藻蓝蛋白的提取率达最大值。藻蓝蛋白在pH值50~70,温度30℃,室内可见光或暗光条件下较稳定;淀粉、蔗糖、明胶、苯甲酸钠等食品添加剂与低浓度条件下的氧化剂和还原剂对其稳定性影响不显著;金属离子Na+、K+、Mg2+和低浓度的Ca2+、Zn2+、Al3+、Fe3+、Cu2+对其稳定性无影响。因此,藻蓝蛋白在弱酸性环境、低金属离子浓度及常用食品添加剂等条件下较稳定,可将其作为天然色素广泛应用于食品工业中。     

鱼腥藻PCC7120藻蓝蛋白α亚基体内重组研究

为了研究藻蓝蛋白α亚基的生物合成途径,通过构建相容的3种重组质粒pETDuet-cpcA、pCOLADuet-cpcE-cpcF和pACYCDuet-ho1-pcyA,将裂合酶基因cpcE和cpcF、血红素氧化酶基因ho1、藻蓝胆素合成酶基因pcyA和脱辅基藻蓝蛋白α亚基基因cpcA共同转入大肠杆菌BL21(DE3)。通过色素蛋白锌电泳和光谱检测表明产生了生物活性的CpcA-PCB。成功实现了大肠杆菌内藻蓝蛋白α亚基84位半胱氨酸残基与PCB的连接。而在裂合酶基因cpcE和cpcF不转入大肠杆菌的情况下,大肠杆菌内只有0.2%的CpcA-PCB产生。以上研究为进一步在大肠杆菌内合成天然的藻蓝蛋白奠定了基础。     

螺旋藻藻蓝蛋白的稳定性及抗癌活性研究

螺旋藻藻蓝蛋白提取物在pH4.0~8.5、40℃以下和弱光环境中表现稳定,并通过MTT比色法测定其对肝癌细胞SMMC-7721和喉癌细胞HEp-2的生长抑制作用,研究了其抗癌活性。     

坛紫菜别藻蓝蛋白α亚基基因的原核表达与鉴定

通过PCR的方法从重组质粒pMD-apcAB中扩增坛紫菜别藻蓝蛋白α亚基基因(apcA),并将其克隆到高效表达外源基因的原核表达质粒pTO-T7。将构建好的质粒导入表达型大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,并对表达产物进行Western-blot和质谱鉴定。结果显示:apcA全长486bp,表达的α亚基(apcA)为带有原核表达载体T7g10的12个起始氨基酸的融合蛋白,其分子量约为19.7KD。0.5mmol/L的IPTG在37℃诱导6h时,apcA的表达量达到最大,达菌体总蛋白50%以上。Western-blot和质谱鉴定的结果表明获得的融合蛋白为重组坛紫菜别藻蓝蛋白α亚基。     

藻胆蛋白短肽性质的研究

在不同温度、ｐＨ条件下,测定了藻胆蛋白短肽中天然色素基团的稳定性,确定了最适保存条件。研究了样品中乙醇含量、微量元素及稳定剂β－胡萝卜素和维生素Ｃ对藻胆蛋白短肽的影响。找出了可使其更稳定的添加剂。     

别藻蓝蛋白的聚集态研究

为了研究鱼腥藻PCC7120（Anabaena sp．PCC7120）中别藻蓝蛋白（APC）α和β亚基（α-APC和β-APC）中藻蓝胆素（PCB）与脱辅基蛋白的生物合成,并在蓝藻体外对这两种色素蛋白PCB—ApcA和PCB-ApcB合成时聚集过程进行分析,通过多种组合的质粒在大肠杆菌体内共同表达进行重组。色素蛋白的吸收和荧光光谱以及Zn电泳表明,在大肠杆菌体内同时得到色素蛋白PCB—ApcA和PCB—ApcB,并且体内重组色素蛋白的细胞荧光光谱显示,色素蛋白以三聚体的形式存在,而破碎细胞后所得上清液所显示的光谱特征为单聚体的特征。     

螺旋藻藻胆体核心复合物结构与功能的研究──四种变藻蓝蛋白复合物的分离及光谱特性的研究

从螺旋藻（Ｓｐｉｒｕｌｉｎａｐｌａｔｅｎｓｉｓ）的藻胆体中分离出四种不同光谱形线的变藻蓝蛋白（ＡＰＣ）复合物：ＡＰＩ,ＡＰⅡ,ＡＰⅢ,ＡＰＢ,利用吸收光谱,荧光光谱（室温和低温）以及荧光激发偏振光谱比较了ＡＰＣ复合物三聚体和单体的光谱特性,四种ＡＰＣ复合物三聚体的最大吸收和最大发射峰位置各不相同,ＡＰⅡ和ＡＰⅢ位于短波区（最大吸收波长在～６５０ｎｍ,最大发射波长在６６２～６６４ｎｍ）ＡＰＩ和ＡＰＢ