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利用枯草杆菌的分泌系统构建分泌型表达载体表达和分泌外源基因产物具有重要的商业价值。我们用鸟枪法克枯草杆菌染色体的启动子和信号肽序列。将克隆的序列连接到能在枯草杆菌中复制的质粒pUB18上,获得分泌型表达载体pUS186。为了测试构建的载体pUS186的功能,将地衣杆菌α-淀粉酶基因的缺失了启动子和信号肽序列的片段重组进该质粒,经过Bal 31酶切,T4 DNA聚合酶补齐等处理,获得pUSA186I 相似文献
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利用枯草杆菌的分泌系统构建分泌型表达载体表达和分泌外源基因产物具有重要的商业价值。我们用鸟枪法克隆了枯草杆菌染色体的启动子和信号肽序列,将克隆的序列连接到能在枯草杆菌中复制的质粒pUB18上,获得分泌型表达载体pUS186。为了测试构建的载体pUS186的功能,将地衣杆菌α-淀粉酶基因的缺失了启动子和信号肽序列的片段重组进该质粒,经过Bal31酶切,T4DNA聚合酶补齐等处理,获得pUSA186Ⅱ及pUSA186Ⅰ系列质粒,将这些重组质粒转化枯草杆菌QB1130(amy-)后都能向胞外分泌淀粉酶,酶活测定结果表明,基因表达水平比用原有的启动子高1-2倍,蛋白质分泌率在84-96%之间。 相似文献
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将克隆的解淀粉芽胞杆菌强启动子经DNA序列分析后连接到能在枯草杆菌中复制的质粒pUB18上,构建枯草杆菌表达载体pUB23。为了测试构建的表达载体能否表达外源基因,将地衣杆菌抉失了启动子的α-淀粉酶基因接到pUB23上启动子的下游,组建重组质粒,转化枯草杆菌QB1130(amy~-),获得能分泌α-淀粉酶的转化株,证明缺失了启动子的结构基因在pUB23上克隆启动子的启动下获得表达。酶活力测定结果表明,表达水平是用原启动子时的2.5倍. 相似文献
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抗冻蛋白结构基因片段的克隆 总被引:2,自引:0,他引:2
为了研究和开发利用抗冻蛋白或多肽,木文通过聚合酶链式反应(PCR)合成了抗冻蛋白110bp的结构基因片段,然后将该基因片段克隆到大肠杆菌质粒载体P(Bluescript)Ⅱks+/-上,获得了重组质粒,经酶切证明,获得的重组质粒中含有抗冻蛋白结构基因片段,以供该基因在大肠杆菌或酵母中表达抗冻蛋白。 相似文献
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枯草杆菌启动子-信号肽序列的克隆及序列分析 总被引:1,自引:1,他引:0
利用含红霉素抗性基因和缺启动子-信号肽序列的氨苄青霉素抗性基因的双功能质粒pGPB14为探针载体,克隆了枯草杆菌的启动子-信号肽序列并对克隆的片段进行序列分析。枯草杆菌染色体DNA经Sau3A酶解后与BomHI酶切的质粒pGPB14连接,转化大肠杆菌C600,筛选抗氨苄青霉素及抗红霉素的转化子,从双抗性转化子中提取重组质粒并经酶切分析,显示克隆的DNA片段在0.27-1.5kb之间。用Sanger的双脱氧链终止法测定了10个克隆片段的DNA顺序,结果表明,克隆的片段都含有启动子、核糖体结合优点及信号肽序列。克隆片段可以在大肠杆菌和枯草杆菌中恢复氨苄青霉素抗性的表型。β-内酰胺酶活力测定结果证明:大肠杆菌的酶活力主要积累在周质空间内而枯草杆菌的酶活力主要分泌到胞外。 相似文献
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目的克隆并构建耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)青霉素结合蛋白2a(PBP2a)全长及转肽酶区的原核表达质粒。方法登录基因文库查找获得mecA基因的编码序列,应用PCR技术扩增获得DNA片段,将此基因片段插入PET-32a载体,同时酶切鉴定阳性克隆,DNA序列测定验证序列正确性。结果 PCR扩增获得了mecA基因全长及转肽酶区DNA片段,成功插入到原核表达载体PET32a,双酶切鉴定及DNA序列测定证实插入片段正确。结论成功构建了PBP2a全长及转肽酶区片段表达质粒,为该蛋白的纯化表达和疫苗研究奠定了基础。 相似文献
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将克隆了枯草杆菌蛋白酶E基因aprE的枯草杆菌质粒pPZW101和一个组成型強启动子Psk连接构建成质粒pPZW102,转入碱性和中性蛋白酶缺失枯草杆菌DB104并进行表达。此质粒-宿主系统具有Subtilisin E高表达和外分泌的特点。 相似文献
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枯草杆菌具有安全性好、产胞外蛋白、产品
中不含内毒素等优点。,14,201,是基因克隆的理想
受体,但也存在某些外源基因不能表达、用鸟枪
法克隆外源基因比较困难等缺点[113,16,181。若能
构建可在大肠杆菌和枯草杆菌中复制和表达的
双功能质粒作为载体,以大肠杆菌为中间寄主,
利用其转化率高,克隆技术比较成熟的优点,先
将DNA片段克隆至大肠杆菌,经过鉴定后再
转至枯草杆菌中表达,则可克服枯草杆菌克隆
系统的以上缺点,有实际应用价值。目前,国外
已利用金黄色葡萄球菌质粒与大肠杆菌质粒重
组构建了一些双功能质粒115,1si,并已通过大肠
杆菌为中间宿主的方法将乙型肝炎病毒核心抗
原、口蹄疫病毒主要抗原117,及人干扰素。0i等基
因转人枯草杆菌中表达。本文描迷了作者之一
等分离的短小芽抱杆菌抗四环素质粒PC J 3121
和大肠杆菌质粒pBR 322分别用Bam HI和
Ava I双酶切,除去部分DNA片段后重组构
建双功能质粒pCB33的实验,并对其性质进行
了研究。 相似文献
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用大肠杆菌启动基因探针质粒pHE5克隆了解淀粉芽胞杆菌的启动基因。供体菌DNA的HindⅢ片段与pHE5重组后转化大肠杆菌,获得一批带启动基因的抗四环素转化子,其中四株的抗性达到200μg/mL,从这四株高抗性转化子中提取质粒,并对其中的一个重组质粒pAE23的插入片段进行限制性图谱分析和缺失研究,获得了一个缺失了部份片段,四环素抗性仍达到200μg/mL的衍生质粒pAED23,经酶切分析证明其上的启动基因位于0.8kb的EcoR Ⅰ—HindⅢ片段上。点杂交分析证实该片段来自解淀粉芽胞杆菌的DNA。将地衣杆菌的α-淀粉酶基因亚克隆至pAED23启动基因下游的HindⅢ位点上能增强该基因在大肠杆菌中的表达。 相似文献
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枯草杆菌启动子—信号肽序列的克隆及序列分析 总被引:1,自引:1,他引:0
利用含红霉素抗生基因和缺启动子-信号肽序列的氨苄青霉素抗性基因的双功能质粒pGPB14为探针载体,克隆了枯草杆菌的启动子-信号肽序列并对克隆的片段进行序列分析。枯草杆菌染色体DNA经Sau3A酶解后与BanHI酶切的质粒pGPB14连接,转化大肠杆菌C600,筛选抗氨苄青霉素及抗红霉素的转化子,从双抗性转化子中提取重组质粒并经酶切分析,显示克隆的DNA片段在0.27-1.5kb之间。用Sanger 相似文献
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目的克隆扩增APC11开放阅读框基因片段,构建其真核表达重组质粒,为后续研究其功能做准备。方法按照GenBank中人APC11序列设计引物,以HeLa细胞cDNA为模板,扩增出基因片段。该片段与真核表达载体pEGFP-C1连接,得到的重组质粒经双酶切和测序鉴定后用Western印迹检验表达。结果扩增片段长度为285bp,重组真核表达质粒经双酶切鉴定后测序鉴定正确。Western印迹证实pEGFP—C1-APC11在真核细胞内表达。结论成功克隆了APC11基因并构建了pEGFP—C1-APC11真核表达重组质粒,Western印迹证实其表达良好,对该基因功能的深入研究打下了坚实基础。 相似文献
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目的:克隆人G0S2基因启动子并构建荧光素酶报告基因载体,为进一步研究G0S2基因转录调控提供质粒。方法:利用PCR技术从人胚肾293A细胞基因组DNA中克隆获得G0S2基因启动子的DNA片段,将其克隆至pGL3-basic表达载体中,并转化人大肠杆菌DH5α,经限制性内切酶酶切、PCR及测序鉴定得到确认;将重组载体质粒与半乳糖苷酶表达质粒psV-β-Galactosidase共转染至大鼠血管平滑肌细胞(VSMC),检测细胞中荧光素酶的活性。结果:pGL3-G0S2-Promoter重组质粒插入片段和相邻序列正确,克隆的G0S2基因片段有启动子活性(P0.05)。结论:成功构建了pGL3-G0S2-Promoter报告基因质粒,为进一步研究G0S2基因的表达奠定了基础。 相似文献
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小鼠Nanog基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达 总被引:4,自引:0,他引:4
按照nanog基因编码序列设计合成引物,利用RT-PCB从小鼠的囊胚期胚胎中扩增得到该 基因,并将该基因克隆到pET-28b(+)载体上,获得pET-28b(+)-nanog原核表达重组质粒,限制 性酶分析和DNA序列测定均证实该克隆插入片段为nanog基因编码序列。重组质粒转化大肠杆 菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达,在大肠杆菌表达系统中获得了高效表达,western杂交证实该 蛋白具有6-His抗原活性,从而证实目的蛋白为Nanog蛋白。 相似文献
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双功能枯草杆菌诱导型高效表达分泌载体的构建与鉴定 总被引:1,自引:0,他引:1
利用大肠杆菌质粒pSP72和枯草杆菌质粒pUB18共整合得到双功能克隆载体pSB。在pSB多克隆位点依次引入枯草杆菌果聚糖蔗糖酶基因启动子-信号肽序列sacBp.s.、地衣芽孢杆菌淀粉酶基因终止子序列α-amyT和短小芽孢杆菌增强子基因degQ,最终构建了双功能枯草杆菌诱导型高效表达分泌载体pSBPTQ。将VasostatinⅠ基因作为靶基因检测sacBp.s.、α-amyT和degQ在pSBPTQ进行外源基因表达时的功能,结果表明,在蔗糖诱导下,sacB启动子有效启动了Vasostatin I基因的表达和分泌,α-amy T提高了VasostatinⅠ基因的转录效率,而degQ明显增强了VasostatinⅠ基因的表达水平。VasostatinⅠ基因在蔗糖诱导下成功表达并分泌到枯草杆菌细胞外,蛋白质分泌效率达到90%左右。质粒稳定性试验结果表明,经过40个世代之后,质粒pSBPTQ在枯草杆菌DB1342中仍旧保持在83%以上。 相似文献