光合磷酸化的量子需要量

用菠菜叶绿体悬浮液,在红光下(620—660mμ,6—8×10~3尔格/厘米~2-秒)测定同位素P~(32)标记的无机磷酸进入ATP的强度,并根据吸收的光能量换算为形成一个分子ATP所需要的红光量子数。结果指出: (1)循环光合磷酸化作用,不论用何种辅助因素(PMS,维生素K_3,FMN),形成一个分子ATP的量子需要量均在4—5之间(最低一次获得2.9)。叶提取液代替辅助因素,结果亦同。(2)与希尔反应偶联的光合磷酸化作用(希尔氧化剂为K_3Fe(CN)_6或TPN)的量子需要量亦是4—6。同时测定的还原作用指出希尔反应中每放出一个分子O_2,需要8—12个红光量子,表示在试验条件下,二者是完全偶联的(P/2e?1)。没有磷酸化(不加ADP及P_i)时,希尔反应的量子需要量不变,表示偶联的ATP形成不需额外的光量子。(3)光强度减低,则循环与非循环光合磷酸化作用的效率随之降低,量子需要量增加,而希尔反应的效率则不变。从上述结果推论,两种光合磷酸化作用均是通过同一的电子传递系统,在此系统中仅有一个磷酸化部位,除非另有一个部位是极易破坏的。试验结果也对光合作用的量子需要量问题,供给可能的解释。在弱光下光合作用效率高,可能是由于部份ATP来自呼吸;而在强光下效率减低,则是呼吸所供给的ATP不足而必需依靠循环光合磷酸化所致。     

光合磷酸化偶联机制的研究寡霉素对PSP、ATP酶和ATP_b-Pi交换反应的作用

在过去工作基础上,我们进一步研究类囊体膜上牢固结合的ATP_b 与Pi 的交换反应和PSP 的关系。主要结果是:①在线粒体中对ATP 酶复合体的疏水蛋白专一敏感的寡霉素,对叶绿体中ATP 的光下形成和水解均表现为抑制,其中对ATP 酶活力的抑制要比对ATP 形成的抑制强烈得多,对核苷酸交换和光下H~ 吸收也有明显的抑制作用(表1)。②去除内源游离核苷酸的叶绿体悬浮液,与Pi(~(31)Pi ~(32)Pi)照光(不外加ADP),发现在适当的寡霉素浓度(20微克/毫克蛋白)下显著促进此系统ATP 中~(32)Pi 参入的数量;并且在所测温度下均促进,温度升高(30℃),促进作用更为明显(表2,3)。③用荧光素酶测定ATP 的方法对上述系统的反应产物进行鉴别,并与~(32)Pi酯化法相比较,证明寡霉素促进的是ATP_b-Pi 交换(图1,2;表4,6)。④ATP_b-Pi 交换反应与类囊体膜的能量转换有密切的关系。这交换反应需光、需辅助因子,也受解联剂的影响(表5),是需能反应。这ATP_b-Pi 交换,较之PSP 受解联剂的影响要小得多,可能它与膜上高能态有更为直接的联系。     

杭州大学生物系为研究生开设现代生物实验技术课

杭州大学生物系为了培养研究生,提高其生物实验技术能力,于1986年4—6月开设了现代生物实验技术课。聘请中国科学院上海植物生理研究所的10位同志讲学。课程内容有:光合作用部分生化反应的测定技术(光合磷酸化,ATP-P交换,电子传递,pH变化,脂质体组装,叶绿体分离)、微量ATP及溶氧量测定原理及其应用(ATP、ADP、AMP放氧,RUDP羧化酶,加氧酶)、硝酸还原酶分析技术(NR提取、     

光合磷酸化偶联机制研究——Ⅱ.金霉素对光合磷酸化促进作用的研究

用金霉素溶液处理菠菜离体叶绿体,对循环( PMS)和非循环光合磷酸化( FeCy、MV或BQ DBMIB)均可表现出促进作用,表明它对两个能量保存部位都有促进作用。它能提高磷酸化的偶联程度,增加ADP/O及PC比值。在对光合磷酸化有促进作用的情况下,用两阶段光合磷酸化法测定,它对高能态的积累略有增加或影响不大,但它能显著增加叶绿体的延迟发光。它对叶绿体膜上Mg~(2 )-ATP_(ase)及偶联因子Ca~(2 )-ATP_(ase)活力有抑制。金霉素溶液的荧光强度可被加入偶联因子所提高,这些都表明金霉素至少有一个作用部位与偶联因子有关。文中对它能促进光合磷酸化作用的机理进行了讨论。     

醋酸酐对叶绿体偶联因子的化学修饰效应

醋酸酐处理叶绿体导致与偶联因子有关的部分反应不可逆的失活,这些反应包括偶联的电子传递、光合磷酸化、膜上腺三磷酶活性、~(32)P?ATP交换和质子吸收。低浓度醋酸酐处理叶绿体,只抑制偶联的电子传递而不影响基础电子传递,表明能量转换的偶联机构对醋酸酐的化学作用更为敏感。膜上偶联因子在合成、水解和交换腺三磷的能力上,均因醋酸酐的作用而减弱。偶联因子中具有这些能力的活性部位可能就是醋酸酐的作用靶子。利用在不同pH的反应介质中测最大反应速度而求出参与酶活性中心的氨基酸pK估计值的方法,认为醋酸酐可能修饰了膜上偶联因子活性部位的氨基残基。     

鱼腥藻类囊体膜及其性质的研究

研究了鱼腥藻(Anabaena azollae Strasb.)的光合膜及其性质,结果如下:(1)以培养液为反应介质,测出鱼腥藻细胞的光合放氧,这种放氧受电子传递抑制剂DCMU的抑制。1mmol/L的NH_4Cl既延迟光合放氧的诱导期又抑制光合放氧速率。(2)在700～300nm波长范围,鱼腥藻出现4个吸收高峰,分别位于680、625、480和440nm处。其中625nm的吸收峰应属蓝绿藻的特有吸收峰。(3)通过高压氮气破碎法,并结合超声波处理,可以破碎鱼腥藻细胞壁,并从中分离出鱼腥藻类囊体膜制剂。测定表明,这种膜制剂具有进行光合磷酸化的能力,同时亦有膜上ATP酶水解ATP的能力。(4)利用此膜制剂,分离并部分纯化出ATP酶,在SDS-PAGE图谱上,此酶的两种小亚基(δ和ε亚基)的分子量分别低于菠菜叶绿体ATP酶的δ和ε亚基,但两种酶的α和β两种大亚基的分子量相近。以上结果提示,鱼腥藻具有进行光合作用的内在机构,这种机构在组分及其性质上与其它种类光合膜的异同是值得深入研究的课题。     

光对花生叶片绿色细胞糖酵解代谢的影响

光下花生叶肉细胞悬浮液暗呼吸只有暗中的18％左右,丙酮酸含量下降,细胞质磷酸丙糖积累,叶绿体3—磷酸甘油醛脱氢酶活性上升,而非叶绿体的酶活性下降,叶绿体和细胞质的ATP/ADP比值同时增加。ATP/ADP>1时离体细胞质3—磷酸甘油醛脱氢酶活性下降,但叶绿体的酶不受影响。表明光下ATP/ADP比值上升影响细胞质3—磷酸甘油醛脱氢酶活性而使糖酵解受抑制。     

去窦弓神经对大鼠脑细胞线粒体氧化磷酸化功能的影响

目的:探讨去窦弓神经对脑细胞线粒体氧化磷酸化功能的影响。方法:用氧电极法及华氏减压法测定线粒体的耗氧量、呼吸控制率(RCR)和二磷酸腺苷/氧比值(ADP/O)。结果:线粒体结构完整性和氧化磷酸化效率明显降低(P0.01),且随时间延长逐渐降低(P0.05或P0.01)。结论:去窦弓神经使脑细胞线粒体的结构和功能遭到一定程度的破坏,且随时间延长日益严重。     

光合磷酸化的研究 Ⅷ.黄化小麦幼苗变綠时光合磷酸化活力的发生

(1)黄化小麦幼苗初变绿时,光合磷酸化活力之发生远较叶绿素的生成为迟。在实验条件下,照光变绿3小时后,才可测得光合磷酸化活力,且其按叶绿素为基础计算的活力随照光变绿时间的增加而增加,至照光变绿7—8小时后,叶绿体上叶绿素含量尚在继续增加,但光合磷酸化活力则趋向恒定。(2)在黄化幼苗变绿初期,测得的循环光合磷酸化ATP形成能力较非循环光合磷酸化ATP形成能力高得多,以后较接近;但将循环光合磷酸化之ATP形成能力与非循环光合磷酸化之放氧能力相比较,则其比例在不同时期相差不大。这说明,在变绿初期非循环光合磷酸化之ATP形成能力特别小的原因,主要是由于当时它的偶联程度特别低,并不是因为它较循环光合磷酸化多牵涉到放氧等步骤,而这些步骤可能发生得较晚所致。以DCPIPH_2作氢供体的氧化光合磷酸化活力的最初增长情况与以Fe(CN)_6~≡作氢受体的非循环光合磷酸化ATP形成能力的增长情况一样,均比以PMS促进的循环光合磷酸化活力增长时间为晚,这结果也有助于证明非循环光合磷酸化ATP形成能力增长较晚的原因与它牵涉到放氧步骤无关。(3)使黄化变绿幼苗光合磷酸化、希尔反应活力达到饱和所需的光强度与绿苗所需的相仿。变绿初期的叶绿体,其光合磷酸化作用有很强的“光强效应”,卽弱光下电子传递速度慢、PSP活力低时,与磷酸化的偶联程度会急剧下降。这现象可能是造成变绿初期测得的非循环光合磷酸化ATP形成能力特别低的原因。(4)黄化幼苗变绿时,同化CO_2能力之发生时间与光合磷酸化活力之发生时间差别不大,但以叶绿素为基础计算,前者的活力较早达到恒定。     

光合磷酸化的研究 Ⅱ.光合磷酸化的“光强效应”及中间产物

(1)在不同光强度下研究叶綠体的光合磷酸化作用和希尔反应,发现当光弱到一定程度后,光合磷酸化的效率,不论是“循环”或是“偶联”的都显著降低,而同时测定的希尔反应的效率则不变。因此,这个“光强效应”为光合磷酸化所特有,显然不是发生在“电子传递系统”或氧化还原部分。(2)在作用液中加入非放射性的ATP或预先照光形成一些AT~32P,再进行实验,这个“光强效应”仍同样出现,证明这个效应不是由于最终产物(ATP)的分解,亦不是由于应用放射性~(32)P测定方法所造成的假象。(3)这个“光强效应”在光强增加到一定程度以上时,即逐渐消失;在较低的温度下则减轻;在闪光条件下则比在连续光下更加显著。这些结果指出,“光强效应”是由于中间产物的破坏或转向其他代谢途径。此作用是一个暗反应,可能是酶促的。酶量少,容易达到饱和,弱光下中间产物少,被它作用的比重就大,强光下中间产物多,被它作用的比重就小,所以“光强效应”只在弱光下显著。(4) 叶綠体加Mg~( )及PMS照以饱和强光,然后立即(<0.1秒)在暗中加入Pi及ADP,仍有很多ATP形成,但如在暗中过5秒钟后再加Pi及ADP,则几乎完全没有ATP形成。这指出叶綠体照光后产生能与Pi结合的中间产物(Z~*),其饱和量约为20—40mμmole/μmole叶綠素。它在室温(20—25度)迅速破坏或转向其他代谢途径,5秒后已不存在,在低温(5度)则可维持数秒。(5) 同样制剂加Pi再照光,然后暗5秒再加ADP,则ATP的产量,比立即加ADP者只减少一半。指出上述的中间产物(Z~*)与Pi结合后形成第二个中间产物(Z～P)在叶綠体内比较稳定。“光强效应”可能主要是Z~*或以前的中间产物被破坏或转向其他用途所引起。     

NaCl及KCl对叶绿体膜上偶联因子腺三磷酶活力的调节

在不外加Mg~(2 )的条件下,激活液中加入30 mMNaCl或15 mM KCl,能促进叶绿体膜上偶联因子的腺三磷酶活力。其促进程度与叶绿素浓度、反应底物ATP浓度及DTT的存在有关。但此促进现象可被加入低浓度的EDTA所消除,NaCl及KCl可将叶绿体内含有的内源或结合态的Mg~(2 )释放出来,有活化腺三磷酶的作用。     

热预处理菠菜叶绿体的能量转换特征

经热预处理（湿度为２５－４５℃,部分实验为２０－３６℃,时间为５－１０min)的菠菜（Ｓpinacia oleracea L.)叶绿体。严重影响其能量转换的各步反应。（１）循环光合磷酸化速率随处理温度而下降。（２）类囊体膜上腺三磷酶失活。（３）光照诱导叶绿体的质子吸收减小;叶绿体的９－氨基吖啶（９－ＡＡ）荧光猝灭减弱,但加二环己基磷二亚胺（ＤＣ－ＣＤ）可以部分恢复９－ＡＡ荧光猝死。（４）叶绿体的延迟发光和△Ａ５１５nm电色效应均出现明显变化。（５）免疫印迹反应结果表明,经４５℃预处理叶绿体的膜上腺三磷酶出现解离,其α亚单位的蛋白量明显减少。（６）预处理温度超过３３℃,叶绿体光系统Ⅰ介导的氧吸收速率也下降,在反应介质中加芥子碱可以部分恢复其氧吸收能力,就这些结果与膜透性变化、耦联因子复合物解离和自由基积累的关系进行了讨论。     

关于卡尔文循环的总反应式

在不同的教科书或专著中,卡尔文循环总反应式的写法多有不同,笔者见到的有: 1 3CO_2+9ATP+6NADPH→ GAP+9ADP+8Pi+6NADP 2 3CO_2+9ATP+6NADPH+6H~+→ GAP+9ADP+6NADP~++8Pi[10] 3 CO_2+3H_2O+3RuBP+9ATP+6NADPH→ GAP+6NADP~++9ADP+9Pi 4 3CO_2+-3H_2O+9ATP+6NADPH_2→     

三苯基锡,二环己基碳二亚胺和寡霉素对叶绿体CF0与CF1功能联系的影响

作用于H~ —ATP酶复合体质子通道的能量传递抑制剂 TPT、DQCD和 OM能明显抑制叶绿体光合磷酸化反应和膜上 ATP酶活性,减小恒态ΛpH值,加速ΛpH和515 nm吸收衰减。这种在正常叶绿体加速H_(in)~ 经CF_0外流与在残缺膜中阻塞质子外流不一致。TPT等物质是干扰了CF_0与CF_1的构象连接,使 CF_0的质子传导失去CF_1的控制,H_(in)~ 无效漏失或质子逆向转移受影响,从而抑制与质子传导紧密相关的光合磷酸化反应和膜上ATP酶活性。     

低浓度硫酸甲酯吩嗪（PMS）对叶片光合放氧的促进作用

外加低浓度循环光合磷酸化电子递体硫酸甲酯吩嗪(PMS)对菠菜、大豆、水稻和小麦叶片光合放氧有促进作用,与此同时叶片ATP含量也得到增加。PMS对经8 mmol L~(-1)NH_4Cl处理过的菠菜叶片的光合放氧也有促进,最适促进浓度比未经NH_4Gl处理的叶片高,促进的幅度也大。幼龄叶与成长叶相比,幼龄叶的光合磷酸化活性和P/O比值低于成长叶片,其光合放氧速率受PMS促进的幅度大于成长叶片。因此光合磷酸化也可以成为光合作用的一个重要限制因素。     

草甘膦对叶绿体能量转换的影响

除草剂草甘膦抑制植物叶绿体光合磷酸化活力,促进希尔反应活力,表现出明显的解偶联效应。它对叶绿体膜上腺三磷酶(ATPase)活力也起抑制效应,说明ATP合成被抑制不是由ATP酶活力变化所引起。这种解偶联现象主要是因光下质子转移受到抑制,在较低浓度的草甘膦影响下,先抑制质醌转移的质子进入膜内腔,浓度增加到20 mM,对水释放质子也有抑制。所以草甘膦对叶绿体能量转换的影响主要反映在质子转移被抑制,引起磷酸化活力受抑制。     

光呼吸对光合过程中磷代谢的影响

与光呼吸受抑制的 2％O_2浓度下相比,在 21％O_2浓度下.离体甘薯叶细胞光合作用最适介质无机磷浓度较低.另外,在21％O_2浓度下,降低甘薯叶细胞介质 NaHCO_3浓度,叶细胞光下吸收介质~(32)Pi的量减少;降低完整菠菜叶绿体介质 NaHCO_3浓度,乙醇酸形成相对加强,而介质~(32)Pi掺入到有机磷化合物的量则相对减少.这些结果表明,有利于光呼吸的条件,可降低光合对外界Pi的需求量.     

光呼吸对光合过程中磷代谢的影响

与光呼吸受抑制的 2％O_2浓度下相比,在 21％O_2浓度下.离体甘薯叶细胞光合作用最适介质无机磷浓度较低.另外,在21％O_2浓度下,降低甘薯叶细胞介质 NaHCO_3浓度,叶细胞光下吸收介质~(32)Pi的量减少;降低完整菠菜叶绿体介质 NaHCO_3浓度,乙醇酸形成相对加强,而介质~(32)Pi掺入到有机磷化合物的量则相对减少.这些结果表明,有利于光呼吸的条件,可降低光合对外界Pi的需求量.     

多元酸和腺核苷酸对电子传递及光合磷酸化的共同作用

多元酸促进无磷酸化状态的电子传递,但当多元酸与腺核苷酸共同存在时,电子传递速度却比腺核苷酸单独作用时更低。多元酸可提高叶绿体的能量转换效率,其作用受磷酸浓度、多元酸浓度以及pH等多种因素的影响。在光暗两阶段光合磷酸化中,暗反应阶段加入多元酸可显著提高ATP合成量,但在照光前加入多元酸,对ATP合成的影响则视在照光前是否同时加入ADP而异。在多元酸促进光合磷酸化的情况下,同一叶绿体制剂经活化后,其偶联因子水解ATP的活力也可为多元酸促进。     

叶绿体结构和功能的研究——Ⅳ、红霉素对叶绿体能量转换的效应

研究了红霉素对叶绿体能量转换的效应,获知:10(-4)M红霉素抑制循环和非循环光合磷酸化,这种抑制是与反应底物ADP非竞争性的。在抑制ATP合成的浓度范围内,红霉素对基础电子传递的速率并无影响,但它抑制因偶联磷酸化而促进的那部分电子传递。红霉素还抑制膜上Mg~(2 )-ATP酶的活性。以上结果表明,红霉素似有光合磷酸化能量传递抑制剂的特点,它的作用部位可能接近膜上CF_2,或ATP酶的催化部位。