猪乳铁蛋白在4种重组乳杆菌中的表达及抑菌活性比较

为了获得优化的猪乳铁蛋白乳杆菌表达系统,并比较重组猪乳铁蛋白的抑菌活性,根据乳杆菌使用密码子的偏嗜性优化合成猪乳铁蛋白成熟肽编码序列,将其克隆到乳杆菌表达载体pPG612.1的XhoⅠ/BamHⅠ位点,获得了plf乳杆菌表达载体质粒pPG612.1-plf。将获得的重组质粒分别电转化入干酪乳杆菌ATCC393、戊糖乳杆菌KLDS1.0413、植物乳杆菌KLDS1.0344和副干酪乳杆菌KLDS1.0652细胞内,获得4种表达猪乳铁蛋白的重组乳杆菌。经木糖诱导,通过Western blotting和激光共聚焦检测重组猪乳铁蛋白的表达,用ELISA方法检测和比较4种重组菌上清中表达猪乳铁蛋白的量,并用琼脂孔穴扩散抑菌法检测4种重组乳杆菌表达乳铁蛋白的抑菌活性。结果表明,乳铁蛋白在4种重组乳杆菌中均得到正确表达,其产物分子量约73 kDa,重组干酪乳杆菌、重组戊糖乳杆菌、重组植物乳杆菌和重组副干酪乳杆菌的重组猪乳铁蛋白表达量分别为9.6μg/mL、10.8μg/mL、12.5μg/mL、9.9μg/mL。重组猪乳铁蛋白对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌、巴氏杆菌和李氏杆菌均有一定的抑菌作用,对金黄色葡萄球菌的抑菌作用最强,且4种重组乳杆菌中重组植物乳杆菌表达产物的抑菌效果优于其他重组菌的表达产物。结果表明在4种乳杆菌中重组猪乳铁蛋白的最佳表达系统为植物乳杆菌,该结果为猪乳铁蛋白的乳杆菌表达系统进一步开发与应用奠定了基础。     

颗粒裂解肽G13结构域在大肠杆菌中的高效融合表达

为高效表达颗粒裂解肽G13结构域并避免G13对宿主菌的毒性, 将人工合成的编码G13的基因片段, PCR扩增后克隆于原核表达载体pThioHisA中, 构建了重组表达载体pThioHisA-G13, 将其转化于大肠杆菌BL21(DE3)中, 经IPTG诱导表达融合蛋白Trx-G13, 表达产物以包涵体的形式存在, 其表达量约占细菌总蛋白的58%。包涵体蛋白经 8 mol/L尿素溶解后, 再经CNBr切割, 阳离子交换层析, 得到纯化的重组G13结构域。琼脂糖扩散法检测表明重组G13结构域多肽具有抗菌活性。     

EGF-SEA融合蛋白在大肠杆菌中的表达和纯化

根据基因库中查到的金黄色葡萄球菌肠毒素A(SEA)基因序列和人体表皮生长因子(EGF)基因序列进行密码子优化,以适于大肠杆菌表达.人工合成SEA基因与EGF基因.将两目的基因克隆至原核表达栽体pFT22b中,经测序验证表明成功构建了重组表达质粒pET22b-EGF-SEA.将构建好的pET22b-EGF-SEA质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导进行表达;SDS-PAGE分析表明融合基因EGF-SEA在大肠杆菌BL21(DE3)中以包涵体的形式得到了高效表达,产物相对分子质量约为44kDa,与理论值大小一致.包涵体经洗涤,变性、复性后用His Bind Kit进行分离纯化,所得蛋白纯度≥95%.高纯度EGF-SEA融合蛋白的获得为进一步研究其生物学活性及肿瘤治疗奠定了基础.     

抑菌蛋白Reg3A的表达纯化与功能

利用原核表达系统表达人源抑菌蛋白Reg3A,经包涵体的复性和纯化获得有体外抑菌功能的活性抑菌蛋白,并对其体外抑菌功能进行初步研究。构建Reg3A原核表达载体PET-32a-Reg3A转化补充稀缺tRNA基因的表达菌株大肠杆菌BL21-Codonplus,阳性重组子采用诱导培养基诱导5h后,采用超声破碎的方法提取包涵体蛋白,经包涵体蛋白的纯化和透析复性后通过Ni-NTA亲和层析交换柱,获得纯度达95%的蛋白质。Western blot鉴定显示在15 kD处有特异性条带。使用纯化后的蛋白进一步进行抑菌圈实验和抑菌活性实验,对获得蛋白的体外抑菌活性进行评估,从而为进一步进行Reg3A蛋白功能的评估及应用奠定基础。     

副溶血弧菌外膜铁蛋白受体pvuA基因的原核表达及产物的诱导条件优化

为构建弧菌铁蛋白受体pvuA重组质粒,提高其在大肠杆菌BL21中的表达产量,优化表达条件,并为其免疫原性研究奠定基础,从副溶血弧菌基因组DNA扩增了弧菌铁蛋白受体pvuA基因,构建了重组质粒pET-28a(+)-ferric vibrioferrin receptor,转入大肠杆菌BL21并经异丙基硫代半乳糖苷（isopropyl β-D-thiogalactoside,IPTG）诱导表达蛋白。在单因素试验的基础上,以菌体初始浓度、诱导时间、诱导温度、诱导剂浓度为自变量,菌体蛋白浓度为响应值,根据响应面法的Box-Benhnken中心设计原理,研究自变量及其交互作用对弧菌铁蛋白产量的影响,利用Design-Expert和响应面分析相结合的方法对诱导条件进行优化。IPTG诱导获得的重组蛋白以包涵体的形式存在,优化后最终确定重组弧菌铁蛋白受体pvuA最佳表达条件为菌体初始浓度OD₆₀₀=0.6,诱导时间10 h,诱导温度37 ℃,IPTG浓度为1.0 mmol·L^-1,此时包涵体沉淀中蛋白含量最高,为11.00 mg·mL^-1。构建了弧菌铁蛋白受体pvuA的大肠杆菌重组表达质粒,通过优化表达条件提高了纯化蛋白产率,为研究弧菌铁蛋白受体蛋白的多克隆抗体的制备和应用奠定了基础。     

猪白细胞介素18基因的克隆、表达及生物学活性检测

通过RT-PCR方法直接从猪脾脏淋巴细胞中扩增出猪白细胞介素18(pIL-18)成熟蛋白基因的cDNA, 克隆到pGEM-T载体, 构建重组质粒pGEM-T-IL18, 转化E.coli JM109感受态细胞, 取PCR和酶切鉴定为阳性的重组质粒进行序列测定。测序结果表明, pIL-18成熟蛋白基因核苷酸长度为474 bp, 编码157个氨基酸。将其克隆到表达载体pGEX6P-1中, 构建重组质粒pGEX-IL18, 转化E.coli BL21感受态细胞, 用IPTG诱导表达。重组菌菌体裂解物SDS-PAGE可检测到相对分子质量为45 kD的重组蛋白, 占菌体总蛋白的28%左右, 以包涵体形式存在。对包涵体进行洗涤, 用MTT法测定表明, 重组蛋白能明显刺激猪脾脏T淋巴细胞增殖反应的活性。     

猪白细胞介素18基因的克隆、表达及生物学活性检测

通过RT-PCR方法直接从猪脾脏淋巴细胞中扩增出猪白细胞介素18(pIL-18)成熟蛋白基因的cDNA, 克隆到pGEM-T载体, 构建重组质粒pGEM-T-IL18, 转化E.coli JM109感受态细胞, 取PCR和酶切鉴定为阳性的重组质粒进行序列测定。测序结果表明, pIL-18成熟蛋白基因核苷酸长度为474 bp, 编码157个氨基酸。将其克隆到表达载体pGEX6P-1中, 构建重组质粒pGEX-IL18, 转化E.coli BL21感受态细胞, 用IPTG诱导表达。重组菌菌体裂解物SDS-PAGE可检测到相对分子质量为45 kD的重组蛋白, 占菌体总蛋白的28%左右, 以包涵体形式存在。对包涵体进行洗涤, 用MTT法测定表明, 重组蛋白能明显刺激猪脾脏T淋巴细胞增殖反应的活性。     

东亚三角涡虫PSA蛋白的表达、鉴定及抑菌分析

PCR扩增含酶切位点的DjPsa基因(ORF),构建了DjPsa基因的原核表达载体pET-28a(+)-DjPsa,转化入Ecoli BL21(DE3)中,经IPTG诱导蛋白表达,SDS-PAGE、Western blotting(His-Tag抗体)分析表达蛋白,抑菌试验检测其活性.结果表明,重组质粒在E.coli BL21(DE3)中以包涵体的形式高效表达,其蛋白的分子大小约为25 kD;Western blotting检测说明得到的蛋白为PSA重组蛋白:抑菌试验显示复性后的PSA具有较强的抑菌作用,为进一步研究它的功能、活性提供基础.     

鸡α干扰素基因的克隆、原核表达及抗病毒效果研究

通过PCR从三黄肉鸡的肝脏基因组中扩增了鸡α干扰素(ChIFN-α)全长基因。序列分析表明ChIFN-α基因全长582bp,亚克隆其成熟蛋白编码基因(489bp),利用基因重组技术构建了E.coli/pET-28a( )-IFNα,使IFN-α置于pET-28a的T7启动子下游并同6×His(多聚组氨酸标签)-Tag融合。经酶切鉴定,DNA测序证实重组质粒构建正确;将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,SDS-PAGE,Western-blot分析证实表达出22kD左右的融合蛋白,表达的蛋白以不溶性的包涵体形式存在并且具有良好的免疫学活性。提纯的包涵体纯度可达70%以上,用镍亲和层析方法纯化蛋白则可达到95%。经透析复性后的蛋白在鸡胚成纤维细胞上能够抑制H9N2禽流感病毒的复制。鸡胚试验中重组干扰素抗病毒效果好在H9N2禽流感病毒攻毒组中,能保护鸡胚并使其孵出率达到100%的重组干扰素最小蛋白含量为2μg;重组干扰素对新城疫病毒复制也有一定的抑制能力,延迟该病毒复制时间为12h至48h;雏鸡试验表明重组干扰素也能较好地抵抗H9N2禽流感病毒对雏鸡的感染。两组试验均表明,亲和层析纯化蛋白是包涵体蛋白活性的20倍左右。     

hGH-双精氨酸C肽人胰岛素原基因的克隆表达及纯化研究

旨在提高基因重组人胰岛素在大肠杆菌中表达的稳定性及表达包涵体蛋白的复性水平.在人胰岛素原N端前融合人生长素N端的一段序列来充当前导肽,同时将C肽设计为两个精氨酸,分10段合成长链寡核苷酸链,利用重叠延伸PCR技术(SOE PCR)扩增得到该基因片段.与表达载体PET-30a连接,转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达.表达的融合蛋白采用Ni-NTA亲和层析纯化,纯化后的蛋白经复性、冻干等步骤后用胰蛋白酶,羧肽酶B双酶切再过DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换柱,收集洗脱峰.对制备所得的胰岛素用SDS-PAGE,Western blot进行性质鉴定,及皮下注射小鼠测定生物活性.结果显示,目的蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中得到了表达,表达产物以不溶性包涵体形式纯在,约占大肠杆菌总蛋白的30%.经Ni-NTA亲和层析得到的重组蛋白纯度为85%,DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换纯化得到单组分胰岛素.Western Blot显示制备所得的胰岛素具有胰岛素免疫原性,皮下给药注射小鼠活性测定表明具有明显的降血糖活性.获得了一种高效生产基因重组人胰岛素的方法,为研究胰岛素类似物奠定了前期基础同时也为今后探索胰岛素的非注射给药途径提供了原料.     

OC-IΔD86 (Oryzacystatin-IΔD86)基因的原核表达及活性分析

根据OC-IΔD86基因序列, 设计合成了7条寡核苷酸片段, 通过重叠延伸PCR技术合成了OC-IΔD86基因, 利用设计好的BamH I/ Xho I酶切位点将OC-IΔD86基因克隆到原核表达载体pet21b中, 在1 mmol/L的IPTG 诱导后5 h, OC-IDD86融合基因在大肠杆菌中得到表达, 表达产物处于可溶状态, 其表达量占总蛋白的11.4%, 可溶性蛋白的16.4%; 利用Ni-NTA系统纯化该蛋白并经PEG20000浓缩后, 活性分析表明该蛋白酶抑制剂在体外表现出对木瓜蛋白酶明显的抑制作用。这为转OC-IΔD86基因的抗根结线虫植物基因工程抗体制备, 以及进一步体内的抗根结线虫研究奠定了基础。     

水稻中cry1Ah1基因密码子优化方案的比较

cry1Ah1基因是本实验室克隆的具有自主知识产权的模式基因,对鳞翅目害虫水稻二化螟等具有高毒力,具有较好的应用前景。为提高cry1Ah1基因在水稻中的表达量,探讨密码子使用频率对基因表达的影响,依据水稻密码子使用频率设计5种不同的优化方案,提高GC含量并去除剪切信号等不稳定因素后合成cry1Ah1基因杀虫活性区域。优化后的基因在大肠杆菌Rosetta(DE3)中正常表达了65 kDa蛋白,表达蛋白对2龄小菜蛾和水稻二化螟初孵幼虫都具有良好的杀虫活性。优化的基因转化水稻日本晴后,PCR阳性率达到87%以上,实时荧光定量RT-PCR和ELISA分析表明全部采用最高频率密码子的优化方案效果最好,Cry1Ah蛋白平均表达量占可溶性蛋白的0.104%。     

以融合蛋白形式在大肠杆菌中表达人MCP－1

将编码人单核细胞趋化蛋白－１（ＭＣＰ－１）的基因亚克隆到大肠杆菌表达载体ｐＥＸ３１Ａ中,在大肠杆菌中表达出ＭＳ２／ＭＣＰ－１融合蛋０白,该表达产物约占菌体总蛋白的１５％左右,Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测表明,表达产物可与ＭＣＰ－１抗体特异反应。采用琼脂糖平板法进行活性测定表明,表达产物具有明显的单核细胞趋化活性,说明Ｎ端融合一段细菌蛋白对ＭＣＰ－１有无趋化活性可能没有影响。     

人类多效生长因子(Pleiotrophin)的全基因合成、原核表达与纯化

PTN作为重要的细胞因子,存在于多种生物体内,参与多种生物学过程,具有刺激细胞增殖、分化、粘附、迁移等多种功能。根据PTN的基因序列及大肠杆菌密码子的偏爱性,人工合成ptn基因,构建pMAL-his-sumo-ptn重组表达载体,将重组表达载体转化到E.coli(Rosetta)中并进行优化表达。融合蛋白在0.4 mmol/L IPTG、37℃条件下诱导3 h表达量最高。收集菌体、纯化、酶切、SDS-PAGE可检测到分子量为18 kD左右的重组蛋白。     

昆虫神经毒素LqhIT2的表达、抗血清制备及活性分析

根据毕赤酵母密码子偏爱性,不改变毒素蛋白质一级结构,设计合成了昆虫神经毒素LqhIT2基因,并分别克隆至大肠杆菌融合表达载体pPET30-a( )和毕赤酵母分泌表达载体pPIC9K.在IPTG的诱导下,神经毒素在大肠杆菌中融合表达,表达产物经镍亲和层析纯化后,用于免疫BALB/c小鼠,制备了特异性较高的抗血清,抗体滴度超过1:128 000.利用制备的抗血清,采用斑点杂交,筛选得到了较高水平分泌表达重组LqhIT2的酵母转化子,摇瓶条件下,毒素表达量约9 mg/L.大肠杆菌表达产物没有生物活性,酵母表达产物经注射蝗虫表现出杀虫活性.     

生长激素释放激素和人血清白蛋白融合蛋白的克隆表达

目的:通过与人血清白蛋白(HSA)融合,延长生长激素释放激素(GHRH)在体内的半衰期。方法:根据毕赤酵母偏爱密码子重新设计GHRH的核酸序列,并通过化学合成和重叠PCR法将GHRH的N端与HSA的C端通过一个11肽的接头连接,获得GHRH和HSA融合的全长基因序列。构建pPIC9-HSA-GHRH表达载体,电击转化毕赤酵母GS115感受态细胞,通过表型筛选和诱导表达实验得到蛋白表达工程菌,对表达产物进行分离纯化和生物学活性分析。结果:克隆了HSA-GHRH融合基因,构建了pPIC9-HSA-GHRH融合表达载体;电击转化后通过表型筛选和诱导表达实验得到蛋白表达工程菌;经分离纯化后,对表达产物的生物学活性分析显示其在体内有促进生长的作用。结论:与人血清白蛋白的融合有效地提高了GHRH的表达水平,并延长了GHRH的半衰期。     

Functional expression of an earthworm fibrinolytic enzyme in <Emphasis Type="Italic">Escherichia coli</Emphasis>

Two cDNA fragments (lrF1 and lrF2) representing a fibrinolytic enzyme gene of F-III-2 (GenBank AB045719), without and with signal peptide coding sequence, were cloned from earthworm Lumbricus rubellus. The two fragments were inserted into bacterial expression vector pET28a (+), respectively. Subsequent expression showed that both lrF1 and lrF2 proteins were produced as an inclusion body form in E. coli BL21 (DE3) pLysE. After protein refolding and purification, the fusion lrF1 and its derivative without poly histidine tags at the N-terminus showed fibrinolytic activity on fibrin plates with relative activity of 134.3 U/mg protein and 139.7 U/mg protein, respectively, whereas the fusion lrF2 and its derivative without the tags at the N-terminus, had no fibrinolytic activity. The results indicated that the E. coli expression system could not recognize the endogenous signal peptide of F-III-2, and the effect of the histidine tags at the N-terminus on the fibrinolytic activity of the expressed protein was insignificant.     

新型抗2-型糖尿病基因重组RMBAY的克隆、表达及生产环节优化

利用基因重组方法构建RMBAY的原核表达载体pKY-BAY,并研究其生产的优化条件。选用大肠杆菌偏爱密码子,用PCR方法合成全长RMBAY多肽基因,并定向插入到高效表达载体pKYB-mcs中,用大肠杆菌ER2566进行表达,融合蛋白经Chitin-Beads柱纯化后,结合在柱上的融合蛋白用β-巯基乙醇诱导蛋白内含肽的N端自动切割,释放目的肽,目的肽由质谱鉴定。 实验结果表明：利用载体pKY-B在大肠杆菌ER2566中,RMBAY能够实现高效表达;在优化的生产条件下,RMBAY的产量可达到6.7mg/L发酵产物,纯度大于98%,质谱鉴定RMBAY的分子量为3.887kDa. 与理论值相符合。     

Cloning, sequencing and expression of a sialidase gene from Clostridium sordellii G12

A 4.3 kb XbaI restriction fragment of DNA from Clostridium sordellii G12 hybridized with a synthetic oligonucleotide representing the N-terminus of the sialidase protein secreted by C. sordellii. This cloned fragment was shown to encode only part of the sialidase protein. The sialidase gene of C. sordellii was completed by a 0.7 kb RsaI restriction fragment overlapping one end of the XbaI fragment. After combining the two fragments and transformation of Escherichia coli, a clone that expressed sialidase was obtained. The nucleotide sequence of the sialidase gene of C. sordellii G12 was determined. The sequence of the 18 N-terminal amino acids of the purified extracellular enzyme perfectly matched the predicted amino acid sequence near the beginning of the structural gene. The amino acid sequence derived from the complete gene corresponds to a protein with a molecular mass of 44,735 Da. Upstream from the putative ATG initiation codon, ribosomal-binding site and promoter-like consensus sequences were found. The encoded protein has a leader sequence of 27 amino acids. The enzyme expressed in E. coli has similar properties to the enzyme isolated from C. sordellii, except for small differences in size and isoelectric point. Significant homology (70%) was found with a sialidase gene from C. perfringens.