蛇肌果糖1,6-二磷酸酯酶精氨酸残基的化学修饰

蛇肌果糖1,6-二磷酸酯酶的精氨酸残基被苯乙二醛或2,3-丁二酮修饰后,可导致酶催化活性以及对AMP 抑制的敏感性的丧失。在修饰时,有底物或AMP 存在,可分别保护酶的这两种性质,表明与活力有关以及与AMP 抑制有关的是两类不同的精氨酸残基。在底物保护了与活力有关的精氨酸残基后,可以观察到修饰引起酶对AMP 抑制的脱敏,完全脱敏后,每一亚基有2个精氨酸残基被修饰。在本文条件下,K~+对酶的激活作用以及K~+存在时酶对AMP 抑制敏感性增强等性质均不因精氨酸残基的修饰而变化。     

蛇肌果糖1,6-二磷酸酯酶激活和抑制状态的进一步研究

蛇肌果糖1,6-二磷酸酯酶(FruP_2ase)在K~+存在下或经枯草杆菌蛋白酶或胰蛋白酶限制性酶解后,其中性pH的活力均有2倍或2倍以上增加。三种高活性形式的酶其紫外差光谱都同酶在尿素中的差光谱峰形基本一致。它们在受底物抑制的阈值、Mg~(2+)活化行为、K_m值、最适pH、同DTNB反应的能力以及巯基修饰后酶活力的变化等方面均有明显不同。说明三种高活性形式的酶构象呈松弛状态,但是在构象上是有差别的。受AMP抑制的酶2个快速反应巯基被DTNB修饰后,其pH7.5活力增加到对照酶活力的2.5倍,在这种条件下可反应的总巯基数为4,这时酶仍可保持在高活性状态。而底物抑制的酶,则观察不到快反应巯基,这种条件下,可反应的总巯基数为14。说明受AMP抑制的酶的构象比受底物抑制的酶的构象更为紧凑。     

植物磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的研究——Ⅳ精氨酸残基在高粱叶片PEP羧化酶催化和调节功能中的作用

应用化学修饰的方法观察精氨酸残基在PEP羧化酶的催化和调节功能中的作用。用丁二酮在硼酸盐缓冲液存在下处理PEP羧化酶使酶活性迅速丧失。其失活速度表现为拟一级反应动力学特性。 低温处理(15℃),或者PEP、G6P、甘氨酸,苹果酸,G6P加甘氨酸和PEP加甘氨酸等酶的底物和效应剂的存在对酶的丁二酮失活均具不同程度的保护作用。PEP和G6P的P_(0.5)值各为4mM和1.5mM。 丁二酮对酶的修饰表现为可逆失活。在Tris-H_2SO_4缓冲液中透析可使被丁二酮修饰而丧失的酶活性恢复。 丁二酮处理还使酶失去对G6P的敏感性,但不影响甘氨酸对酶的调节作用。低温(15℃)下丁二酮修饰酶的G6P脱敏速度比常温下(30℃)底物保护的修饰酶的G6P脱敏速度慢。比较脱敏速度常数(k_(dG6P))前者是0.0116(分~(-1)),后者是0.0562(分~(-1))。甘氨酸的加入不影响底物保护的修饰酶的G6P脱敏速度而明显降低酶的丁二酮失活速度。 这些结果表明精氨酸残基不仅存在于酶的催化部位并为酶的催化所必需,同时还存在于酶的G6P结合部位而参与G6P对酶的调节功能。     

米曲霉GX0011β-糖基转移酶的化学修饰及活性中心研究

用化学修饰法及其修饰动力学对米曲霉GX0011β-果糖基转移酶的活性中心结构进行了研究。结果表明：NBS、PMSF、EDC能显著抑制酶的活性,底物对这些抑制有明显的保护作用,且残留酶活与修饰剂的浓度相关,抑制均符合拟一级动力学规律,进一步动力学分析,初步认定该酶活性中心包括至少一个丝氨酸（或苏氨酸）、一个色氨酸和一个天冬氨酸（或谷氨酸）残基。pCMB、TNBS能显著抑制酶的活性,但底物对抑制无明显保护作用,推断半胱氨酸和赖氨酸残基可能与维系酶活性中心构象有关,但不是酶活性中心基团。DEPC、AA和NAI对酶的活性抑制作用不明显,排除了组氨酸、精氨酸和酪氨酸残基是该酶活性中心必需基团的可能。     

米曲霉GX0011β-果糖基转移酶的化学修饰及活性中心研究

用化学修饰法及其修饰动力学对米曲霉GX0011β-果糖基转移酶的活性中心结构进行了研究。结果表明：NBS、PMSF、EDC能显著抑制酶的活性,底物对这些抑制有明显的保护作用,且残留酶活与修饰剂的浓度相关,抑制均符合拟一级动力学规律,进一步动力学分析,初步认定该酶活性中心包括至少一个丝氨酸（或苏氨酸）、一个色氨酸和一个天冬氨酸(或谷氨酸)残基。pCMB、TNBS能显著抑制酶的活性,但底物对抑制无明显保护作用,推断半胱氨酸和赖氨酸残基可能与维系酶活性中心构象有关,但不是酶活性中心基团。DEPC、AA和NAI对酶的活性抑制作用不明显,排除了组氨酸、精氨酸和酪氨酸残基是该酶活性中心必需基团的可能。     

植物磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的研究——Ⅶ.PEP羧化酶必需赖氨酸残基的化学修饰

本文报道纯化的高粱叶片PEP 羧化酶经氨基修饰剂TNBS 和PLP 的修饰迅速失活。酶的TNBS 失活与保温时间和抑制剂浓度呈函数关系并表现为拟一级反应的特性。动力学资料表明酶仅被1分子TNBS 修饰即失活。TNBS 修饰酶的吸收光谱特性表明被修饰的是酶蛋白的赖氨酸残基。底物(PEP)和效应剂(G6P)保护酶免被TNBS 失活。计算G6P 和酶的解离常数K_d-2.39×10~(-3)M。酶的其他反应组分HCO_3~-和MgCl_2单独存在时均不影响TNBS 对酶的失活作用。在被TNBS 修饰过程中还导致酶对G6P 迅速脱敏,同时却保持酶对甘氨酸的敏感性。     

棉铃虫可溶型海藻糖酶的化学修饰

【目的】本研究旨在通过分析化学修饰剂对棉铃虫Helicoverpa armigera可溶型海藻糖酶活性的影响,以明确海藻糖酶活性中心的结构特点和氨基酸构成。【方法】采用化学修饰方法,测定不同修饰剂处理后棉铃虫5龄幼虫海藻糖酶催化活性的变化,进而通过化学修饰反应失活常数来推测酶活性中心的特定氨基酸残基数量。【结果】采用8 mmol/L水溶性碳二亚胺(carbodiimide,EDC)溶液和25 mmol/L苯甲酰甲醛(phenylglyoxal,PG)溶液分别对棉铃虫5龄幼虫海藻糖酶羧酸基团和精氨酸残基进行修饰后,其活性分别减少81.58%和54.14%,这表明对羧酸基团和精氨酸残基的修饰可有效抑制海藻糖酶活性。底物海藻糖可保护海藻糖酶不受修饰剂的影响。修饰动力学结果显示,海藻糖酶活性中心可能包含1个羧酸基团和2个精氨酸残基。【结论】结果表明,含有羧基的谷氨酸和天冬氨酸是海藻糖酶活性中心的催化残基,精氨酸是维持海藻糖酶活性的必要残基。本研究结果可为开发新型农药提供理论支持。     

植物磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的研究——Ⅶ.PEP羧化酶必需赖氨酸残基的化学修饰

本文报道纯化的高粱叶片PEP羧化酶经氨基修饰剂TNBS和PLP的修饰迅速失活。酶的TNBS失活与保温时间和抑制剂浓度呈函数关系并表现为拟一级反应的特性。动力学资料表明酶仅被1分子TNBS修饰即失活。TNBS修饰酶的吸收光谱特性表明被修饰的是酶蛋白的赖氨酸残基。底物(PEP)和效应剂(G6P)保护酶免被TNBS失活。计算G6P和酶的解离常数K_d=2.39×10~(-3)M。酶的其他反应组分HCO_3~-和MgCl_2单独存在时均不影响TNBS对酶的失活作用。在被TNBS修饰过程中还导致酶对G6P迅速脱敏,同时却保持酶对甘氨酸的敏感性。     

脱卤酶化学修饰的研究

脱卤酶是催化α-卤酸转化为α-羟基酸的酶。本文用各种化学修饰剂对脱卤酶YL、109和H-2进行化学修饰。实验结果表明作用于丝氨酸、赖氨酸、色氨酸残基的试剂对酶活无明显影响,而作用于组氨酸、精氨酸和带羧基氨基酸残基的试剂使酶活降低。底物对化学修饰剂有保护作用。组氨酸、精氨酸和带羧基氨基酸(答氨酸或天冬氨酸)残基为脱卤酶活力所必需。     

鳗弧菌胞外金属蛋白酶的化学修饰研究

用DEPC、EDC、DTNB、PMSF等8种化学修饰剂对鳗弧菌胞外金属蛋白酶进行了化学修饰。结果表明化学修饰后酶的活力发生了改变,其中组氨酸、酸性氨基酸、半胱氨酸残基的化学修饰引起酶活性的明显降低,说明组氨酸残基、酸性氨基酸、半胱氨酸残基及其二硫键在维持酶活力中发挥重要作用,是酶活力所必需;而对精氨酸、丝氨酸、ε-氨基等修饰后酶活性影响较小,表明不是酶的活性所必须的基团。     

组氨酸残基在乙醇酸氧化酶活性中的作用

DEPC能显著抑制GAO的活性。其失活速度表现为假一级动力学特性,并和抑制剂浓度成线性正比关系。底物乙醇酸可保护GAO免受DEPC抑制,羟胺能使被抑制的酶重新复活。光谱测定表明,被抑制的酶只有组氨酸残基被修饰,而酪氨酸残基未被修饰,修饰前后酶的氨基含量均无变化。反应动力学表明,在35℃下,GAO中有一个pK为6.5的解离基团和催化活性有关,其解离⊿H为31610 J/mol。因此组氨酸残基为GAO催化活性的一个必需基团。     

葡萄糖淀粉酶色氨酸残基及底物结合位点的研究

 本文用N-溴代琥珀酰亚胺(NBS)对葡萄糖淀粉酶进行特异性修饰,当酶分子表面有3个色氨酸残基被修饰后,酶活力完全丧失。用邹氏图解法测得酶活性中心有一个色氨酸残基是必需的。如果在酶液中加入不同的底物再用NBS氧化,用荧光发射和荧光猝灭光谱检测表明,底物对酶分子有不同程度的保护作用。在被测试的三种底物中,这种保护能力依为糊精>淀粉>麦芽糖。     

分枝犁头霉α-半乳糖苷酶的氨基酸组成及化学修饰

α-半乳糖苷酶进行氨基酸组分分析,结果为含有较多的酸性及巯水性氨基酸,较少的组氨酸、酪氨酸及半胱氨酸。 用几种蛋白质侧链修饰试剂对α-半乳糖苷酶进行化学修饰。在一定条件下,当巯基及酪氨酸残基分别被NEM、IAA及NAI修饰后,酶活力不受影响,说明这些基团与活力无关。当羟基、组氨酸及色氨酸残基分别被EDC、DEP、NBS及HNBB修饰后,酶活力大幅度下降,说明这些基团或者参与了酯催化作用或者位于酯活性位区附近。     

背角无齿蚌碱性磷酸酶的功能基团研究

在一定条件下分别采用PMSF、DTT、PCMB、NBS、TNBS、SUAN、BrAc及IBr等化学修饰剂选择修饰背角无齿蚌碱性磷酸酶的多种氨基酸残基,并测定其酶活力变化。结果表明,PMSF、NBS、TNBS、SUAN、DTT的修饰能显著抑制酶的活力,活力的降低与修饰剂的浓度相关。BrAc、IAc、PCMB的修饰不表现对酶的抑制作用。作者初步认为,Ser、Lys和Trp残基是背角无齿蚌碱性磷酸酶的必需功能基团,部分二硫键时保护酶的催化功能也是必需的。     

大肠杆菌AS1.357 L-天门冬酰胺酶的选择性化学修饰

用九种化学修饰剂研究了大肠杆菌AS1.357 L-天门冬酰胺酶分子中的五种不同氨基酸侧链基团与催化活性的关系。结果说明,渡酶活力与硫氧墓完全无关;与色氨酸、精氨酸和组氨酸亦无直接联系;而酪氨酸残基和羧基的修饰引起酶活力急剧下降。其中酪氢酸残基巳被证实是该酶活力的必需基团,处于该酶分子的活性部位。     

柞蚕抗菌肽D中精氨酸、赖氨酸和色氨酸等氨基酸残基的化学修饰

用不同的化学试剂修饰了柞蚕抗菌肽D分子中的色氨酸、精氨酸和赖氨酸等氨基酸残基。NBS修饰抗菌肽D,以及氨肽酶M对抗菌肽D作用的结果表明色氨酸残基对抗菌肽D抑制E.coli D31的作用影响不大。CHD和MLH对精氨酸和赖氨酸残基的修饰,导致抗菌肽D失去抑制E.coli的作用,但可逆地消除CHD和MLH的修饰作用后,抗菌肽D恢复了对E.coli D31的抑菌作用。这些结果初步认为,抗菌肽D抑菌作用与分子中的荷电性有关,改变了分子的电荷,也就同时失去了其抑菌功能。 此外,对精氨酸残基修饰的结果还表明,抗菌肽D的免疫原性与精氨酸残基有关。但是,抗菌肽D的免疫决定簇与其生物活性中心并不完全平行。     

猪心线粒体F_1-ATP酶的水解活性与色、酪氨酸残基相关的构象的关系

线粒体H~ -ATP酶具有双向功能,即ATP的合成与ATP的水解。H~ -ATP酶的头部F_1具有催化这二种功能的活性部位,F_1的活性表现位与它结合核苷酸的类型、数目以及亲和力有关。至于F_1分子活性部位中什么结构与这两种功能有关,目前尚不肯定。自1960年以来关于线粒体F_1的水解功能与其结构中氨基酸残基关系的研究,多采用特异的化学试剂去修饰某些氨基酸残基,然后测其水解活力被抑制的情况。Senior认为不是含—SH基的半胱氨酸而是酪氨酸残基,还可能包括色氨酸残基与ATP的水解有关。也有报道认为是与组氨酸、谷氨酸或精氨酸残基有关。现在蛋白质结构     

表面活性剂Tween-20对离体小麦根钾离子运转的影响

低浓度的Tween-20不仅抑制小麦离体根的K~ 吸收,而且还引起K~ 的外流。抑制K~ 吸收和促进K~ 外流的程度随着Tween-20浓度的提高,处理时间的延长而加深。Tween-20对K~ 运转的抑制作用,可以用去离子水洗去。Twen-20浓度在0.01～0.01％范围内促进小麦根细胞膜上KCl刺激的ATP酶活力,但它的浓度在0.05％以上时则抑制这种ATP酶的活力。延长Twen-20预处理膜-ATP酶的时间,Tween-20抑制膜-ATP酶活力的作用增强。Tween-20抑制 K~ -ATP酶活力的程度大于Mg~(2 )-ATP酶。Tween-20的分子透入细胞膜之后,可能暂时引起膜类脂双分子层分子结构的改变,影响了膜对K~ 的透性;还可能变动膜-ATP酶周围的脂肪环境,当膜-ATP酶的脂肪环境受到Tween-20轻微影响时,酶活力被促进;当脂肪环境的变动加大时,酶活力被抑制。Tween-20对膜-ATP酶活力的影响可能是它影响小麦根细胞K~ 主动吸收的原因。     

产气气杆菌茁霉多糖酶的研究II．化学试剂对酶活力的影响

研究了某些化学试剂对产气气杆菌 Aerobacter aerogenes 的茁霉多糖酶 (Pullulanase EC3.2.1.41)活力的影响。Hg2+,Cu2+,Al3+,Fe3+等金属离子对酶活力有强烈的抑制作用,Ca2+,Mg2+有激活作用。1×10-3M的β-环状糊精完全抑制酶的活力,是竞争性抑制剂,其抑制常数Ki为0．55×10-5M。8M尿素,1.0M的盐酸胍,0.5％的SDS等蛋白质变性剂导致酶活力的完全丧失,在反应体系中有5×10-4M的Ca2+时,对酶有明显的保护作用。色氨酸残基的专一性修饰剂N-溴代琥珀酰亚胺(简称NBS)在1×10-4M的浓度下使酶活力完全丧失,甚至在1×10-5M的浓度下,只保留9％的活力,酶液在用NBS处理前加入不同浓度的底物,对活力有明显的保护作用,表明色氨酸残基对于茁霉多糖酶的活力是十分重要的。     

若干化学修饰剂对PLA2酶活力的影响

利用化学修饰的方法研究了修饰后的ＰＬＡ２与其酶活力之间的关系。结果表明色氨酸、精氨酸及氨基酸被修饰后ＰＬＡ２酶活力均有不同程度的下降。