慢病毒介导的GFP-Hsp90αE47A 基因在HepG2 细胞表达及对 细胞增殖性影响的研究

目的:建立真核细胞表达的GFP-Hsp90αE47A基因重组慢病毒载体三质粒包装细胞系统,并检测其对细胞增殖性的影响,为进一步研究HSP90分子伴侣功能奠定基础。方法:制备完整的重组慢病毒载体三质粒系统:转移质粒(Hsp90αE47A/psin-GFP),包装质粒(ΔNRF)及包膜蛋白质粒(VSV-G)。磷酸钙法将三质粒共转染293T包装细胞,48h后收集病毒上清。将制备好的慢病毒颗粒感染HepG2细胞,在荧光显微镜下观察报告基因GFP的表达情况,Westernblot检测HepG2细胞GFP-Hsp90α表达。MTT法检测细胞增殖情况。结果:转染后的293T和感染后的HepG2细胞能观察到较强的绿色荧光,培养液上清病毒滴度约为3.0×103ifu/μl,HepG2细胞中有GFP-Hsp90α蛋白的表达。内源性Hsp90α表达无明显上升(为对照组的1.05±0.15倍,P<0.05,t检验),有明显外源性GFP-Hsp90αE47A蛋白的表达,为对照组内源性Hsp90α的0.68±0.12倍。外源性GFP-Hsp90αE47A蛋白的表达HepG2细胞增殖活性于第4d有明显抑制。(1.051±0.03vs1.349±0.05,P<0.05,t检验)。结论:成功建立重组慢病毒载体的三质粒包装细胞系统,并将GFP-Hsp90αE47A基因在HepG2细胞中稳定表达,且并未引起细胞明显的热休克反应而导致的内源性Hsp90α增高;且能明显抑制细胞增殖,为后期Hsp90α分子伴侣功能进行研究奠定基础。     

慢病毒载体介导RAB27A基因过表达对人HepG2肝癌细胞增殖的影响

目的：构建RAB27A基因慢病毒表达载体,并研究RAB27A 对人HepG2肝癌细胞增殖能力的影响。方法：以pEGFP-C1-RAB27A质粒为模板,PCR扩增出融合绿色荧光蛋白的RAB27A基因全长,酶切后插入穿梭载体pENTR/U6,再应用Gateway技术,基因重组到表达载体pHAGE-EF1α-puro-DEST上,构建得到重组慢病毒表达载体pHAGE-GFP-RAB27A-puro。测序鉴定序列正确后,将其与包装质粒psPAX2和包膜质粒pMD2.G共转HEK-293T细胞进行慢病毒包装。收集并浓缩培养上清以获得慢病毒颗粒感染HepG2细胞。荧光显微镜下观察HEK-293T细胞和慢病毒感染HepG2细胞绿色荧光强度;Western blot检测稳定感染HepG2细胞株RAB27A 蛋白表达水平;CCK8和平皿克隆形成实验检测稳定过表达RAB27A的HepG2细胞增殖活力的变化;流式细胞术检测稳定过表达RAB27A的HepG2细胞周期分布情况。结果：经双酶切及测序结果证实重组慢病毒表达载体构建正确;浓缩后病毒滴度较高;重组慢病毒感染HepG2细胞后,细胞外源RAB27A的蛋白表达水平显著上调,HepG2细胞的增殖活力和克隆形成能力受到明显抑制（P<0.01）,S期细胞分布比例明显降低（P<0.01）。结论： RAB27A 基因重组慢病毒表达载体构建成功,外源过表达RAB27A 基因可显著抑制HepG2细胞增殖能力。RAB27A在肝细胞癌发生发展和迁移中扮演了重要角色。     

靶向XBP1S的RNA干扰质粒对细胞增殖的影响

目的 构建靶向人XBP1S的siRNA真核表达载体（pSUPER-XBP1S）并观察其对人HeLa细胞和HepG2细胞增殖能力的影响.方法 设计并合成针对XBP1S基因的siRNA,退火成互补双链后克隆至真核表达载体pSUPER构建重组质粒,并将其转染入HeLa细胞和HepG2细胞中.采用RT-PCR检测转染前后XBP1S在HeLa细胞和HepG2细胞中的转录,Western印迹检测转染前后XBP1S蛋白的表达;MTT法、细胞计数检测重组质粒对HeLa细胞和HepG2细胞增殖能力的影响.结果 重组质粒能有效地抑制HeLa细胞和HepG2细胞中XBP1S基因的转录和表达;转染HeLa细胞和HepG2细胞后,细胞增殖抑制率及细胞增殖数与对照组比较,差异有统计学意义（P〈0.05）.结论 成功构建了靶向人XBP1S的siRNA表达载体pSUPER-XBP1S,并且有效的抑制了HeLa细胞和HepG2细胞中XBP1S的转录和表达,有效抑制了细胞的增殖能力.     

TRAIL 慢病毒载体构建及其在肝癌细胞中的表达

目的:构建携带TRAIL基因的慢病毒表达载体并实现其在肝癌细胞株HepG2中的稳定高表达。方法:构建TRAIL重组慢病毒表达载体pCDH-CMV-TRAIL-EF1-GFP-T2A-Puro,脂质体法将重组慢病毒载体和包装质粒混合物共转染293T细胞,包装产生慢病毒颗粒,纯化并测定病毒滴度。利用Western blotting检测TRAIL蛋白在HepG2中的表达。结果:酶切以及测序证实,成功构建TRAIL基因重组慢病毒载体,纯化的慢病毒滴度为1.02×104ifμ/μL。利用嘌呤霉素筛选获得稳定表达TRAIL的细胞系,经Western blot方法检测到TRAIL蛋白的稳定高表达。结论:成功构建了带有TRAIL基因的慢病毒载体,并实现其在HepG2的稳定高表达。     

MIR-122 慢病毒表达载体构建及稳定转染HepG2 细胞系

目的:构建人mir-122慢病毒表达载体,感染肝癌细胞HepG2,建立稳定表达mir-122的HepG2细胞系。方法:以人has-mir-122成熟序列,设计并合成引物,采用PCR的方法扩增目的基因,并连接到慢病毒表达质粒pGCSIL-GFP(含绿色荧光蛋白GFP基因)中。对重组质粒进行双酶切鉴定后,进行mir-122基因慢病毒(pGCSIL-GFP-miR-122)的包装及病毒滴度测定,用构建好的慢病毒表达载体感染HepG2细胞,qPCR检测感染后细胞中MIR-122的变化。通过流式细胞仪检测荧光蛋白GFP,westernblot检测mir-122靶分子CAT-1,验证pGCSIL-GFP-miR-122在HepG2细胞中的表达效果。结果:pGCSIL-GFP-miR-122经双酶切分析及测序,插入序列正确。qPCR检测显示转入病毒后mir-122在细胞中的表达显著提高。表明mir-122慢病毒表达载体构建成功。流式细胞仪根据GFP荧光筛选纯化感染后细胞,感染率达90%以上。Western blot显示mir-122明显抑制其靶分子表达。进一步验证pGCSIL-GFP-miR-122在细胞中的稳定表达。结论:成功构建mir-122慢病毒表达载体,并建立稳定表达的细胞系,为研究mir-122在人体所起的作用及功能机制打下基础。     

MIR-122 慢病毒表达载体构建及稳定转染HepG2 细胞系

目的:构建人mir-122慢病毒表达载体,感染肝癌细胞HepG2,建立稳定表达mir-122的HepG2细胞系。方法:以人has-mir-122成熟序列,设计并合成引物,采用PCR的方法扩增目的基因,并连接到慢病毒表达质粒pGCSIL-GFP(含绿色荧光蛋白GFP基因)中。对重组质粒进行双酶切鉴定后,进行mir-122基因慢病毒(pGCSIL-GFP-miR-122)的包装及病毒滴度测定,用构建好的慢病毒表达载体感染HepG2细胞,qPCR检测感染后细胞中MIR-122的变化。通过流式细胞仪检测荧光蛋白GFP,westernblot检测mir-122靶分子CAT-1,验证pGCSIL-GFP-miR-122在HepG2细胞中的表达效果。结果:pGCSIL-GFP-miR-122经双酶切分析及测序,插入序列正确。qPCR检测显示转入病毒后mir-122在细胞中的表达显著提高。表明mir-122慢病毒表达载体构建成功。流式细胞仪根据GFP荧光筛选纯化感染后细胞,感染率达90%以上。Western blot显示mir-122明显抑制其靶分子表达。进一步验证pGCSIL-GFP-miR-122在细胞中的稳定表达。结论:成功构建mir-122慢病毒表达载体,并建立稳定表达的细胞系,为研究mir-122在人体所起的作用及功能机制打下基础。     

靶向ADAM17基因RNA干扰慢病毒载体的构建及慢病毒包装

目的构建靶向ADAM17基因RNA干扰（RNAi）慢病毒载体及包装慢病毒。方法根据人ADAM17mRNA序列设计4个靶序列,合成4对寡核苷酸序列,同时合成1对阴性对照寡核苷酸序列;将以上5对寡核苷酸序列退火后连入pLVTHM质粒,经酶切和测序鉴定。将重组慢病毒质粒转染至A549细胞,以Real-time PCR检测A549细胞中ADAM17 mRNA表达。将干扰效果最佳的质粒载体和包装质粒共转染至293T细胞,包装产生病毒颗粒。以流式细胞术检测重组慢病毒的滴度。结果酶切和测序证实干扰靶序列已被准确克隆到pLVTHM质粒载体。pLVTHM-ADAM17-siRNA1-4均可显著抑制A549细胞ADAM17 mRNA的表达,其中pLVTHM-ADAM17-siRNA4的抑制效果最佳。LV-ADAM17-siRNA4重组慢病毒的滴度为2.16×108TU/ml。结论成功构建了靶向人ADAM17基因RNAi慢病毒载体及包装了重组慢病毒。     

Ratiometric-pericam-mt慢病毒的构建及其线粒体钙检测功能的验证

目的:基于由环状异构黄色荧光蛋白(Circularly Permuted EYFP)改造的具有线粒体定位功能的Ratiometric-pericam-mt(rp-mt)荧光蛋白构建携带有rp-mt基因的慢病毒载体,验证其在线粒体钙检测中的功能,为进一步研究线粒体钙稳态在细胞生命活动中发挥的作用提供参考依据。方法:采用慢病毒载体EF-1αF-puro和rp-mt质粒构建携带有rp-mt基因的重组慢病毒载体,经脂质体法在293T细胞中与包装质粒共转染,收集构建好的重组慢病毒EF-1αF-puro-rp-mt并体外感染人肝癌细胞SNU-739,验证重组慢病毒EF-1αF-puro-rp-mt的活性功能。结果:以慢病毒载体EF-1αF-puro为骨架质粒,成功构建了携带有rp-mt基因的重组慢病毒载体(EF-1αF-puro-rp-mt),收集获得的重组慢病毒滴度为4×10~6TU/m L。将携带有rp-mt基因的慢病毒EF-1αF-puro-rp-mt感染SNU-739细胞48小时后,在荧光显微镜下观察到有超过85%的细胞发出绿色荧光,定位于细胞线粒体内,且对SNU-739细胞进行Ru360和CGP37157处理后,细胞荧光强度随线粒体内钙水平改变而增强或减弱。结论:采用脂质体包装法成功构建了携带有rp-mt基因的重组慢病毒EF-1αF-puro-rp-mt,细胞经该慢病毒转染后可稳定表达具有线粒体定位功能的荧光蛋白rp-mt,准确地检测细胞线粒体钙离子水平。     

低表达HSP90α和高表达HSP90β HepG2细胞株的建立

目的:建立HSP90α低表达和HSP90β高表达HepG2细胞株。方法:通过电转染方法将质粒pSilencerHSP90α和pSmycHSP90β转染入HepG2细胞中,应用Western-blotting和MTT法分别鉴定转染效果及绘制细胞生长曲线。结果:带有HSP90αsiRNA片段的质粒和带有HSP90β片段的质粒成功转入HepG2中,转染细胞与未转染细胞生长情况无差别。结论:电转染方法可以有效地将质粒转染入HepG2中去,转染细胞的生长情况将不会影响后续实验的结果。     

含分泌型萤光素酶和绿色荧光蛋白双报告基因的慢病毒载体的制备与表达分析

目的:制备含分泌型萤光素酶和绿色荧光蛋白双报告基因的慢病毒载体,为慢病毒载体的进一步广泛应用奠定基础。方法:克隆构建含分泌型萤光素酶和绿色荧光蛋白双报告基因的转基因载体pCS-gluc-2A-eGFP,酶切与序列分析鉴定其正确后,与包装质粒pCMVHR’Δ8.2、包膜质粒pVSV-G共转染293FT细胞,获得含分泌型萤光素酶和绿色荧光蛋白双报告基因的重组慢病毒载体;重组慢病毒载体感染A549、Huh7细胞后,用荧光显微镜直接观察报告基因GFP的表达,或取细胞上清实时检测分泌型萤光素酶的表达。结果:制备了含双报告基因的重组慢病毒载体,感染细胞后可以活体观察绿色荧光蛋白的表达,也可以快速灵敏地检测到分泌型萤光素酶的表达。结论:所获含分泌型萤光素酶和绿色荧光蛋白双报告基因的重组慢病毒载体感染效率高,表达易于活体实时检测,灵敏度高。本研究为慢病毒载体的广泛应用奠定了基础。     

介导大鼠结缔组织生长因子基因沉默的慢病毒载体转移质粒的构建及鉴定

目的：构建介导大鼠结缔组织生长因子（CTGF）基因沉默的慢病毒载体转移质粒pGCL-CTGF,为进一步包装慢病毒载体奠定基础。方法：以大鼠CTGF基因为靶基因,根据RNA干扰（RNAi）序列设计原则,设计4对有小发夹结构的RNAi靶点序列,退火形成双链DNA,双酶切后定向克隆到慢病毒载体转移质粒pGCL-GFP中,构建4个含靶基因片段的重组慢病毒载体转移质粒pGCL-CTGF,并对质粒进行PCR及测序鉴定。结果：CTGF的短发夹RNA（shRNA）片段被成功克隆到慢病毒载体转移质粒pGCL-GFP中,4个插入序列与设计的靶基因片段完全一致。结论：构建了能够表达4个含CTGF靶基因片段的慢病毒载体转移质粒,为进一步包装介导CTGF基因沉默的慢病毒载体奠定了基础。     

大鼠miR-126慢病毒表达载体的构建及其在肝星状细胞中的表达

目的：肝星状细胞（hepaticstellatecell,HSC）激活并发生表型改变是肝纤维化形成的关键,本实验期待通过构建慢病毒mo—miR．126,并体外转染Hsc,为研究miR．126在肝纤维化中的作用奠定实验基础。方法：PCR扩增miR-126的前体,构建miR．126的重组表达载体pCDH．CMV-MCS．EFl．copGFP-miR．126,脂质体法转染包装细胞293TN细胞,包装产生慢病毒,以293TN细胞绿色荧光蛋白（greenfluorescentprotein,GFP）的表达水平测定病毒滴度,构建重组慢病毒（Lentivims,LV）载体（Lv．miR．126）,体外转染活化的HSC．T6,荧光显微镜观察荧光阳性细胞百分率,real—timePCR检测miR一126转入水平。结果：经PCR扩增检测阳性菌落和测序证实,成功构建携带大鼠miR一126基因重组慢病毒载体。倒置荧光显微镜下观察可见包装细胞293TN呈绿色荧光,并测得滴度108〉ifu／ml。荧光显微镜下HSC的荧光阳性率在95％以上。Real—timePCR检测证实miR-126转染后获得了较高的表达。结论：成功构建大鼠慢病毒载体Lv—miR-126,并可在体外高效稳定表达,为本研究后续对miR-126靶点验证和功能研究奠定实验基础。     

大鼠过氧化物酶体增生因子激活受体γ基因慢病毒表达载体的构建与鉴定

目的：构建大鼠过氧化物酶体增生因子激活受体γ（peroxisomeproliferator-activatedreceptorgamma）基因慢病毒表达载体,获得可供转染的滴度,为进一步研究该基因在肝星状细胞活化（Hepaticstellatecells,HSC）及肝纤维化中的作用机制提供物质基础。方法：大鼠PPAR-γ基因序列进行PCR扩增,与经AgeI酶切后的pGC-FU-3FLAG载体连接产生慢病毒载体表达质粒pGC-fu-3flag-PPARG,转化DH5α,PCR筛选阳性克隆,测序并转入293T细胞Western blot鉴定,而后将pGC-fu-3flag-PPARG,pHelper 1.0,pHelper 2.0三质粒共转染293T细胞,包装成慢病毒,收集上清浓缩病毒测定病毒滴度。结果：DNA测序及Westernblot鉴定证实构建的大鼠PPAR-γ基因慢病毒表达载体pGC-fu-3flag-PPARG正确,浓缩慢病毒悬液的滴度为2×108TU/ml。结论：成功构建携带大鼠PPAR-γ基因的重组慢病毒表达载体。     

CXCR4慢病毒载体的构建及其在人脐带血间充质干细胞的表达

目的：构建趋化因子CXC亚族CXCR4的慢病毒表达载体并观察其转染人脐带间充质干细胞后的表达。方法：用逆转录PCR方法获取CXCR4基因编码区片段,将构建的慢病毒载体质粒pLVTHM-EGFP-CXCR4与包装质粒psPAX2和包膜质粒pMD2．G共转染293T细胞,包装生产慢病毒。用相同滴度的慢病毒转导等量间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cell,MSCs）,后采用Real time PCR检测CXCR4 mRNA、Western Blot方法检测蛋白质的表达。结果：PCR、酶切和测序结果表明成功的构建了CXCR4基因重组慢病毒载体。同时用该慢病毒载体转染MSCs后可有效地增加MSCs中CXCR4的表达。结论：成功构建了CXCR4的慢病毒表达载体并能在MSCs中表达,为进一步研究其在干细胞移植中的应用奠定基础。’     

第三代慢病毒包装系统优化及Rev表达质粒对慢病毒包装效率作用初探

目的:对目前最为常用的三质粒慢病毒包装系统进行优化,以期明确各质粒表达的病毒成分对提高慢病毒包装效率的重要性。方法:在限定总质粒量为10μg的情况下,将表达绿色荧光蛋白(GFP)的目的质粒、表达gag/pol、Rev、VSVG的包装质粒按不同比例混合,转染293T细胞进行病毒包装,48 h后收集上清用于感染293T及K562细胞,72 h后经流式细胞术检测GFP+阳性细胞比例,分析所获病毒的感染效率。结果:采用不同的质粒混合比例包装的病毒感染效率具有明显差异,其中携带GFP的目的质粒量影响作用最为显著,当目的质粒量从15%(1.5μg)增至35%(3.5μg)时,GFP+293T细胞比例从14.2%升至45.1%,增加了3.2倍。当固定目的质粒量为35%,同时分别将表达gag/pol或Rev的质粒量从15%提高到25%时,改变Rev组的GFP+阳性率提升最明显,为1.5倍;而改变VSVG质粒量在已测试的混合比例中作用不显著。包装病毒感染K562细胞的结果与293T细胞类似。结论:通过对比包装病毒的感染效率,优化了慢病毒包装的混合质粒条件,并成功地应用于感染白血病细胞系;首次发现提高Rev质粒量可以更有效地提高病毒的包装效率,为利用慢病毒表达体系研究多种基因在血液系统中的功能奠定了技术基础。     

HCV core 1b亚型和HA共表达重组腺病毒载体的构建与鉴定

目的：构建HCV core 1b亚型和HA共表达的腺病毒载体并予以鉴定。方法：合成HCV核心蛋白1b亚型的核苷酸,连接入pcmv5-HA质粒中。用XhoⅠ单酶切,后用Klenow酶补平,再用HindⅢ单酶切下HA-HCV core 1b片段,连入pShuttle-cmv穿梭质粒中,构建穿梭质粒pShuttle-CMV-HA core 1b.将pShuttle-CMV-HA core 1b转化至含有AdEasy-1的BJ5183感受态细菌中进行同源重组。PacⅠ酶切线性化重组质粒pAd-HA-HCV core 1b并转染AD293细胞进行病毒包装和扩增。用RT-PCR检测HA-HCVcore 1b的mRNA的表达水平,并用Western blot检测融合表达蛋白HA-HCV core 1b的表达水平。结果：穿梭质粒pShuttle-CMV-HA-HCV core 1b经PCR和测序证实构建成功。重组腺病毒载体经AD293细胞包装后,可观察到CPE现象。用获得的重组腺病毒载体感染AD293细胞,经RT-PCR检测,在mRNA水平上有表达;经Western blot检测,HCV core 1b亚型腺病毒载体（Ad-HA-HCV core 1b）感染组与未感染腺病毒载体组及空白对照组相比,只有Ad-HA-HCV core 1b感染组有融合蛋白HA-HCVcore 1b的表达。结论：通过分子克隆体外重组技术,成功构建了HCV core 1b亚型和HA共表达的重组腺病毒载体Ad-HA-HCVcore 1b。为进一步研究丙型肝炎病毒1b亚型引起丙肝感染中胰岛素抵抗的作用机制提供了方法。     

低氧诱导因子和角质细胞生长因子双基因重组腺病毒的构建及其在肺泡上皮细胞中的表达

目的：构建同时携带低氧诱导因子-1α（HIF-1α）和角质细胞生长因子（KGF）N腺病毒载体（pAdxsi-GFP-HIF-KGF）,观察其在防治肺损伤潜在的应用前景。方法：低氧处理A549细胞后提取总RNA并逆转录为eDNA作为模板,依据GeneBank公布的HIF-1α cDNA设计引物,并分别引入KpnI和BamHI酶切位点,PCR扩增后将目的基因HIF-1α连接到载体pShuttle-CMV-EGFP上,构建重组质粒pShuttle-GFP—HIF。然后以质粒plRES2-EGFP-KGF为模板,用引入NheI和PmeI酶切位点的引物PCR扩增KGF基因并克隆到重组质粒pShuttle-GFP-HIF上,获得穿梭质粒重组质粒pShuttle—GFP-HIF—KGF。采用细菌内重组方法将目的序列重组到pAdxsi病毒骨架栽体上构建携带HIF．10t和KGF双基因的重组腺病毒载体pAdxsi-GFP-HIF-KGF。检测重组腺病毒滴度后,转染人肺泡上皮细胞A549,检测目的基因的转染表达。结果：通过对构建质粒克隆进行测序及酶切,证实携带HIF—lot和KGF双基因的重组腺病毒载体pAdxsi-GFP-HIF-KGF构建成功,且构建的重组腺病毒纯度好、滴度高。用pAdxsi-GFP-HIF-KGF以100MOI转染A549细胞后24h后在荧光显微镜下可观察到细胞有较强的绿色荧光表达,48h时荧光更强;转染48hELISA法检测培养上清中HIF-1蛋白表达水平为（56．36±4．53）ng／mL,KGF蛋白表达水平为（60．20±2．92）ng／mL。结论：成功构建了腺病毒栽体pAdxsi-GFP-HIF-KGF,其转染效率及目的基因的蛋白表达水平较高,具有潜在的进一步在肺损伤局部应用的前景,为后期制备可以同时发挥KGF、HIF-1作用的基因治疗药物打下基础,同时为高海拔地区应激性急性肺损伤的有效防治提供实验基础。     

HAX1和EGFP共表达重组腺病毒载体的构建、鉴定

目的构建和鉴定HAX1和EGFP双基因共表达重组腺病毒载体。方法采用DNA重组技术,将目的基因HAX1克隆至含有报告基因EGFP的穿梭质粒pAdTrack—CMV中,并转化于大肠埃希菌DH5a;筛选出重组质粒pAdTrack—CMV—HAX1,并在BJ5183细菌中与pAdEasy-1质粒进行同源重组,产生重组腺病毒载体;用lipofectamine将其转染HEK293细胞,包装携带全长HAX1的重组复制缺陷型腺病毒pad—HAX1-EGFP,酶切和序列测定鉴定;用制备好的Ad—HAX1-EGFP感染HEK293细胞,流式细胞术检测其感染效率,RT—PCR、Western印迹鉴定外源基因HAX1的表达。BrdU检测感染了Ad—HAX1-EGFP的HEK293细胞增殖情况。结果pAdTrack—CMV—HAX1重组质粒构建成功。pAdTrack—CMV—HAX1质粒与pAdEasy-1质粒同源重组后与预期结果相符。构建好的Ad—HAX1-EGFP能有效感染HEK293细胞;外源基因能在239细胞中有效表达。HAX1高表达的HEK293细胞其增殖率得以提高。结论成功构建了表达HAX1和EGFP共表达的重组腺病毒载体,HAX1能够促进结肠癌细胞HEK293细胞的增殖。