人HIF—1α miRNA干扰质粒的构建及其在Lovo细胞中有效性的检测

目的：构建人HIF—1α的miRNA特异性干扰表达载体并转染人结肠癌Lovo细胞检测其有效性。方法：设计合成针对人HIF—1α基因的特异性miRNA前体寡核苷酸,依次通过退火、连接,构建含HIF—1α前体miRNA的重组干扰质粒pcDNA？6．2-GW／EmGFP—HIF—1α—miR,并转染人结肠癌Lovo细胞,经半定量RT-PCR技术鉴定其干扰有效性。结果：经双酶切及测序鉴定,针对人HIF—1α基因的两组miRNA干扰质粒构建成功,并能够有效抑制人结肠癌Lovo细胞中HIF-1αmRNA表达。结论：成功构建针对人HIF—1α基因的miRNA特异性有效干扰质粒,为后续HIF—1α基因慢病毒miRNA表达载体的构建及其在结肠癌多药耐药中的相关功能研究奠定基础。     

人CUIAA重组腺病毒载体的构建及其在PC-12细胞中的表达特点

目的构建并鉴定带有绿色荧光蛋白（green fluorescence protein,GFP）报告基因的人源CUL4A（hCUIAA）基因腺病毒表达载体Ad—hCUIAA—GFP,探求bCUIAA在PC-12细胞中的表达特点。方法扩增hCUIAA基因,并通过In—FusionPCR克隆技术构建穿梭质粒pDC315-EGFP—hCUIAA,利用AdMaxTM腺病毒包装系统将该穿梭质粒与腺病毒表达载体骨架质粒pBHGloxAEl,E3Cre共转染HEK293细胞,经GFP荧光检测和Western印迹检测确认hCUIAA的表达后,进一步通过病毒扩增及纯化得到hCUL4A重组腺病毒载体Ad—hCUIAA—GFP。将该载体转染Pc—12细胞,观察hCUIAA—GFP融合蛋白在Pc-12细胞中的表达情况。结果成功获得了较高滴度的腺病毒载体Ad—hCUIAA—GFP（1．6×10^12pfu／m1）。荧光检测表明,Ad—hCUIAA—GFP转染Pc-12细胞后72h内,病毒转染率随着时间和病毒转染滴度的增加而增加。DAPI细胞核荧光染色结果表明,hCUIAA—GFP的表达主要集中在细胞质部分。GFP荧光检测及Western印迹检测结果显示,hCUIAA—GFP在Pc-12细胞中的表达量随时间和病毒转染滴度的增加而增加。结论带GFP的hCUIAA重组腺病毒载体Ad—hCUIAA—GFP构建成功,掌握了其转染Pc-12细胞的最佳滴度及其在Pc-12细胞中的时空表达特点,为今后对hCUIAA在PC-12细胞中的功能性研究奠定了基础。     

AdEasy重组腺病毒系统对Ad-HIF1α的构建和鉴定

目的:采用AdEasy重组腺病毒系统构建重组腺病毒Ad-HIF1α并进行鉴定。方法:使用高保真PCR从EST克隆中扩增HIF1α基因编码区,并用限制性内切酶BamH I和Xba I对PCR片段限制性酶切,用T4 DNA连接酶将其连接至同样经BamH I和Xba I限制性酶切的穿梭载体pAdtrace-TO4,构建穿梭载体pAdtrace-HIF1α;将pAdtrace-HIF1α与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1在细菌BJ5183中同源重组,得到重组腺病毒质粒pAd-HIF1α;pAd-HIF1α经Pac I酶切后转染至E1表达包装细胞系HEK293中进行HIF1α基因表达腺病毒包装,重复扩增,氯化铯密度梯度离心法纯化,获得高滴度Ad-HIF1α;感染干细胞株C3H10T1/2,通过荧光蛋白的表达了解其感染效率,并应用PCR及Western blot验证目的基因的表达,并通过检测下游靶基因VEGF的表达,了解该载体表达的目的蛋白的生物活性。结果:重组腺病毒质粒pAd-HIF1α,经PCR及酶切分析验证构建正确;在HEK293中进行HIF1α基因表达腺病毒包装,经反复冻融4次使细胞裂解,获得高滴度重组腺病毒载体;通过红色荧光蛋白(Red fluorescence protein,RFP)表达,观察到Ad-HIF1α能够高效感染C3H10T1/2细胞,并通过PCR证实了HIF1α在C3H10T1/2细胞较对照组明显高表达;在感染Ad-HIF1α的C3H10T1/2细胞中,HIF-1α下游靶基因血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的表达明显增高,证实表达的目的蛋白具有生物活性。结论:应用AdEasy重组腺病毒系统成功构建Ad-HIF1α,并证实其具有生物活性,为后续研究奠定了基础。     

抑制RAGE表达的siRNA重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的构建特异性针对细胞膜上晚期糖基化终末产物受体（RAGE）的小干扰RNA（siRNA）腺病毒载体,鉴定其对大鼠胰岛β细胞系INS-1细胞RAGE表达的影响。方法设计并合成针对大鼠RAGE基因的siRNA的靶DNA序列,克隆于穿梭载体pAdTrack中,与腺病毒骨架质粒pAdeasy-1在BJ5183细菌中进行同源重组,脂质体法转染至QB1293A细胞中包装,获得RAGE—siRNA的重组腺病毒,荧光显微镜观察RAGE—siRNA感染INS-1细胞后绿色荧光蛋白（GFP）的表达,Western印迹检测RAGE的蛋白表达。结果成功制备RAGE—siRNA重组腺病毒,在INS-1细胞中RAGE—siRNA感染效率达到90％以上,并能够抑制INS-1细胞RAGE的表达。结论成功构建了携带RAGE的siRNA重组腺病毒载体,能有效沉默INS-1细胞中RAGE的表达。     

Anti-HIF-1α-pEGFP重组质粒的构建及表达

目的构建EGFP-HIF-1α反义重组质粒,转染人宫颈癌Hela细胞,用以探讨HIF-1α蛋白在宫颈癌的生长、转移中的作用。方法应用基因重组技术构建EGFP-HIF-1α反义重组质粒,通过脂质体介导将其转染入Hela细胞,倒置荧光显微镜观察转染效果,Western blot检测HIF-1α蛋白的表达。结果酶切鉴定结果显示含EGFP-HIF-1α反义重组质粒构建成功,并能在Hela细胞中封闭HIF-1α蛋白的表达。结果 EGFP-HIF-1α反义重组质粒构建及转染成功,封闭Hela细胞中HIF-1α蛋白的表达,为进一步研究HIF-1α蛋白在宫颈癌的生长、转移中的作用提供试验基础。     

VEGFR-3基因转染淋巴管内皮祖细胞后可溶性VEGFR-3蛋白的分泌

目的研究携带BABL/c小鼠VEGFR-3（1-3Ig）基因的重组腺病毒转染淋巴管内皮祖细胞（LEPCs）后,对可溶性VEGFR-3蛋白分泌及其生物学特性的作用。方法采用巢式RT-PCR技术从BABL/c小鼠胎盘组织中扩增VEGFR-3（1-3Ig）的编码基因,并通过重组PCR技术在基因的N端加上人CD33的信号肽。将该基因片段亚克隆入腺病毒表达载体（pDC316-IRES-EGFP）,重组质粒经酶切及测序验证后,与包装质粒共转染293细胞以产生重组腺病毒。将构建好的携带有小鼠VEGFR-3（1-3Ig）基因的重组腺病毒转染淋巴管内皮祖细胞,通过ELISA检测转染细胞上清液中可溶性VEGFR-3蛋白的分泌及其对VEGF-C的中和作用。结果成功构建了带有信号肽的BABL/c小鼠VEGFR-3（1-3Ig）基因的腺病毒表达质粒,并获得高滴度的携带有小鼠VEGFR-3（1-3Ig）基因的重组腺病毒,重组腺病毒转染淋巴管内皮祖细胞后,可使转染细胞分泌可溶性VEGFR-3蛋白,该蛋白具有中和VEGF-C的作用。结论成功地制备了携带BABL/c小鼠VEGFR-3（1-3Ig）基因的重组腺病毒,用该病毒转染淋巴管内皮祖细胞可使其分泌可溶性VEGFR-3,该蛋白在体外具有中和VEGF-C的作用,这为临床抑制肿瘤淋巴管新生奠定了基础。     

携带EGFP基因的戊型肝炎病毒重组质粒的构建及其感染性的验证

为了构建携带增强型绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescent protein,EGFP)基因的戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus,HEV)重组质粒,转染人肺癌细胞A549细胞验证其感染性,PCR法分两段扩增HEV全基因组序列和EGFP基因序列,将EGFP报告基因插入到HEV ORF2基因下游,并克隆到体外转录表达载体pGEM-7Zf(+)上。然后利用脂质体转染法将重组质粒转入A549细胞,24h后在荧光显微镜下观察EGFP的表达;转染72h后,利用免疫荧光法检测HEV ORF2蛋白的表达。转染7d后将发生病变的A549细胞收集作为接种物,接种A549细胞验证携带EGFP的HEV-EGFP重组病毒的感染性。结果显示经酶切和测序鉴定携带EGFP的HEV重组表达质粒pGEM-HEV-EGFP构建成功;EGFP基因与HEV在A549细胞中可融合表达;携带EGFP的HEV重组表达质粒转染A549细胞7d后出现病变,并且连续传代3代仍具有感染性。本研究成功构建了携带EGFP的HEV全基因组重组质粒pGEM-HEV-EGFP,并成功感染A549细胞,为进一步研究HEV的复制机制及致病机理奠定基础。     

氧化铁磁性纳米颗粒介导缺氧诱导因子1α shRNA质粒转染逆转A549/CDDP细胞对顺铂耐药的实验研究

评价了氧化铁磁性纳米颗粒作为缺氧诱导因子1α shRNA (HIF-1α shRNA) 重组质粒载体进行体内体外转染的可行性及其逆转人肺腺癌耐药细胞株(A549/CDDP)顺铂耐性的效果,并初步探讨相关机制．在成功构建HIF-1α shRNA重组质粒后,分别利用氧化铁磁性纳米颗粒及脂质体介导质粒转染A549/CDDP细胞及其移植瘤裸鼠动物模型,荧光显微镜检测转染效率,RT-PCR及细胞免疫化学检测转染后A549/CDDP 细胞HIF-1α、多药耐药相关蛋白1(multidrug resistance 1,MRP1)、肺耐药相关蛋白(lung resistance-related protein,LRP) mRNA及蛋白质表达,免疫组化检测转染后A549/CDDP移植瘤HIF-1α、MRP1及LRP蛋白表达,MTT法检测转染HIF-1α shRNA前后A549/CDDP细胞对顺铂的耐药性,并检测转染HIF-1α shRNA后A549/CDDP细胞移植瘤的肿瘤生长指数,HE染色检测纳米颗粒转染对裸鼠肝、肾及脑的组织学毒理作用．结果显示,氧化铁磁性纳米颗粒介导转染相对效率高于脂质体介导(P < 0.01),HIF-1α shRNA转染A549/CDDP细胞后HIF-1α、MRP1、LRP mRNA及蛋白质表达下降,逆转A549/CDDP细胞对顺铂耐性82%,纳米颗粒介导HIF-1α shRNA转染A549/CDDP细胞移植瘤裸鼠动物模型后,移植瘤组织中HIF-1α、MRP1及LRP蛋白表达下降,转染HIF-1α shRNA后抑制移植瘤的生长,且与顺铂有协同效应,纳米颗粒转染后裸鼠肝、肾及脑组织无坏死．这些结果说明,纳米颗粒介导HIF-1α shRNA的体内体外转染效率高于脂质体,RNA干扰技术封闭HIF-1α基因可较大程度逆转耐顺铂人肺腺癌细胞的耐药性及其抑制瘤的生长,其作用可能与HIF-1α shRNA降低HIF-1α、MRP1及LRP表达有关,HIF-1α基因可作为逆转肺癌耐药治疗的有效靶点,磁性纳米颗粒介导HIF-1α shRNA质粒转染具有一定的生物安全性．     

携带红色荧光蛋白报告基因的重组腺病毒载体的构建

目的采用体外连接技术构建含红色荧光蛋白(RFP)报告基因的重组腺病毒载体,为基因治疗与基因疫苗研究提供重要工具。方法将pTurbo RFP-N上的含红色荧光蛋白基因片段,经酶切连接定向克隆至转移载体pShuttle上,构成重组质粒pShuttle-TurboRFP-N。用I-CeuI/PI-SceI双酶切重组质粒pShuttle-TurboRFP-N和骨架质粒pH5′040 pkGFP-II,回收目的片段,连接,获得重组腺病毒载体pH5.′040.CMV.RFP-N。将其线性化后,经脂质体介导转染至AD293细胞内包装出重组腺病毒颗粒。通过荧光显微镜观察其在AD293细胞内的包装效率和RFP表达情况。扩增并再次感染AD293细胞检测病毒颗粒感染能力,并测定其生物活性及滴度。结果经酶切鉴定,证明已正确构建重组腺病毒载体AdH5.′040.CMV.RFP-N;经AD293细胞包装成具有感染性的病毒颗粒,并能在真核细胞中高效表达目的基因;扩增纯化后获得重组腺病毒颗粒数为3.6×1012vp/mL,滴度达1×1010pfu/mL。结论成功构建了携带红色荧光蛋白报告基因的重组腺病毒载体,并能够在AD293细胞中高效地表达,为基因治疗与基因疫苗研究提供重要工具。     

视黄酸核受体γ重组腺病毒构建及其鉴定

目的构建携带大鼠视黄酸核受体γ（retinoic acid receptor γ,RARγ）的重组腺病毒,为研究RAR3,在骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）成神经分化中的作用奠定基础。方法体外扩增大鼠础研基因,将其定向克隆至腺病毒穿梭质粒pAd Trace—TOX构建重组质粒pAdTrace—RARγ,并在BJ5183菌中与骨架质粒pAd Easy-1重组获得腺病毒载体pad—RARγ,Pac I酶切后转染HEK293细胞包装腺病毒。腺病毒Ad—RARγ感染大鼠MSCs,Real—time PCR和Western印迹检测RARγ的表达。结果PCR,酶切及测序均证实础研正确克隆至腺病毒质粒载体中,Ad—RARγ对MSCs感染率达60％～70％,并明显增强础研基因和蛋白的表达。结论成功构建携带RARγ的重组腺病毒,并具有上调大鼠MSCsRA脚基因和蛋白表达的功能。     

腺病毒介导重组hKGF基因转染HaCat细胞及其表达

将PCR扩增得到的人角质细胞生长因子（hKGF）基因片断插入穿梭载体pAdTrack-CMV,产生重组质粒pAdTrack-CMV-hKGF,经Pme I线性化后,通过电转法导入含腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的大肠杆菌BJ5183进行同源重组,得到重组腺病毒质粒pAdEasy-hKGF。采用Lipofectamine 2000将pAdEasy-hKGF转染到HEK-293细胞,在HEK-293细胞中包装并扩增出大量的腺病毒,经PCR鉴定含有hKGF基因。获得的重组hKGF腺病毒感染颗粒可高效感染HaCat细胞。Western-blot结果显示,重组腺病毒感染的HaCat细胞可分泌表达hKGF蛋白。     

SOCS3基因重组腺病毒的构建及其在猪脂肪细胞中的表达

本研究旨在构建细胞因子信号转导抑制因子3(Suppressor of cytokine signaling 3,SOCS3)的重组腺病毒表达载体,获得有感染性的病毒颗粒。以pcDNA3-SOCS3质粒为模板扩增SOCS3基因,将其亚克隆至腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV,经测序验证后,重组的穿梭质粒用PmeI酶切线性化后转化到BJ5183感受态细菌中与其内的骨架载体pAdEasy-1进行同源重组,获得的重组质粒pAd-SOCS3,经PacI线性化后转染至HEK293细胞中进行包装和扩增,纯化后用TCID50法测定病毒滴度。以重组的病毒感染原代培养的猪脂肪细胞后,荧光显微镜下观察报告基因GFP的表达,RT-PCR和Western blotting检测细胞内SOCS3 mRNA和蛋白的表达。重组腺病毒载体pAd-SOCS3经酶切及PCR鉴定正确,病毒滴度为1.2×109PFU/mL;感染原代培养的猪脂肪细胞后,荧光显微镜观察可见报告基因GFP的表达;RT-PCR和Western blotting检测到细胞中SOCS3 mRNA和蛋白的表达显著提高。本研究成功构建了SOCS3基因的重组腺病毒,感染原代培养的猪脂肪细胞可稳定表达SOCS3蛋白,为深入研究SOCS3的功能奠定了基础。     

分泌睫状神经营养因子腺病毒载体的构建及小量复制病毒增强其分泌表达的研究

目的：探讨复制型腺病毒能否增强增殖缺陷型腺病毒Ad5-hCNTF所携带外源基因的表达分泌。方法：亚克隆获得分泌型睫状神经营养因子的基因（ciliary neurotrophic factor）,然后将此基因插入到穿梭质粒pshuttle。pshuttle-hCNTF经pme1酶切后,CIAP去磷酸化,利用Ad-EASY腺病毒制备系统,将其与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1共同转化大肠杆菌BJ5183,通过同源重组,筛选出含目的基因的重组型腺病毒质粒的菌株,获得大量该质粒后转染病毒包装细胞AD-293,成功包装出一种血清5型增殖缺陷型腺病毒Ad5-hCNTF。结果：经PCR鉴定该病毒含有该基因片断,Western blotting证实该病毒感染细胞后能表达CNTF蛋白。采用ELISA法检测培养液证实感染细胞能高水平地分泌CNTF。结论：体外实验表明在不同滴度的复制型腺病毒Ad5-E1＋E3＋的带动下,该病毒感染细胞后分泌表达目的蛋白的水平显著提高,为今后应用Ad作为基因治疗的载体提供实验证据。     

脂肪储存小滴蛋白5重组腺病毒的制备

目的：利用AdEasy腺病毒表达系统构建含有小鼠脂肪储存小滴蛋白5（LSDP5）基因的重组腺病毒。方法：从小鼠肝脏cDNA克隆出LSDP5基因全长,克隆至pMD18-T载体中,酶切测序。回收酶切产物,连接到腺病毒穿梭载体pShuttle-CMV,构建pShuttle-CMV-LSDP5重组质粒,经PmeI酶切线性化后转化至含有腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的BJ5183中。筛选阳性克隆,提取重组质粒,PacI酶切线性化并转染AD293细胞进行包装,提取病毒DNA,鉴定重组病毒并检测病毒滴度。结果：LSDP5基因克隆经测序证实与Genebank公布一致,双酶切重组pMD18-T载体得到1400 bp左右的片段。重组穿梭载体经Kpn I和Sal I双酶切后得到预期片段。PacI酶切得到30 Kb大片段和4.5 Kb小片段。转染AD293细胞后收集病毒,经PCR鉴定,获得理想的目的片段。取病毒上清反复感染AD293细胞以扩增病毒,最后所得病毒滴度为2.5×109pfu/ml。结论：成功构建了携带脂肪储存小滴蛋白5基因的重组腺病毒载体,为进一步研究LSDP5基因功能奠定基础。     

人核糖核酸酶抑制因子基因重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的构建含有人核糖核酸酶抑制因子（hRI）基因的重组腺病毒载体。方法以含有全长cDNA的pT7-RI为模板,PCR扩增hRI,经T载体克隆后,酶切亚克隆到穿梭质粒pAdTrack—CMV上,在BJ5183细菌内和pAdEasy-1同源重组。筛选阳性克隆,酶切、PCR及测序鉴定,线性化后脂质体法转染293细胞进行包装、扩增。通过观察绿色荧光蛋白（GFP）的表达及PCR扩增目的基因等方法鉴定重组的腺病毒。结果酶切鉴定及PCR结果证明hRI基因重组腺病毒载体构建成功,病毒滴度为1．5×10^10 pfu/ml。结论应用细菌内同源重组法成功构建了含hRI基因的重组腺病毒载体。     

分泌睫状神经营养因子腺病毒载体的构建及小量复制病毒增强其分泌表 达的研究

目的:探讨复制型腺病毒能否增强增殖缺陷型腺病毒Ad5-hCNTF所携带外源基因的表达分泌。方法:亚克隆获得分泌型睫状神经营养因子的基因(ciliary neurotrophic factor),然后将此基因插入到穿梭质粒pshuttle。pshuttle-hCNTF经pme1酶切后,CIAP去磷酸化,利用Ad-EASY腺病毒制备系统,将其与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1共同转化大肠杆菌BJ5183,通过同源重组,筛选出含目的基因的重组型腺病毒质粒的菌株,获得大量该质粒后转染病毒包装细胞AD-293,成功包装出一种血清5型增殖缺陷型腺病毒Ad5-hCNTF。结果:经PCR鉴定该病毒含有该基因片断,Western blotting证实该病毒感染细胞后能表达CNTF蛋白。采用ELISA法检测培养液证实感染细胞能高水平地分泌CNTF。结论:体外实验表明在不同滴度的复制型腺病毒Ad5-E1+E3+的带动下,该病毒感染细胞后分泌表达目的蛋白的水平显著提高,为今后应用Ad作为基因治疗的载体提供实验证据。     

结缔组织生长因子基因RNA干扰复制缺陷型腺病毒载体的构建及鉴定

目的：构建能介导结缔组织生长因子（CTGF）基因RNA干扰的复制缺陷型腺病毒表达载体。方法：以大鼠CTGF基因为靶序列,设计并合成含编码短发夹RNA序列的寡核苷酸,构建腺病毒穿梭质粒P-shuttle-CTGF,酶切及测序分析正确后,与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1共转染AD-293细胞,进行病毒包装,得到腺病毒载体Ad．H1-CTGF,用该载体感染HSC-T6细胞,观察其对CTGF基因表达抑制的效果。结果：构建的腺病毒穿梭质粒p-shuttle-CTGF经酶切、测序分析证实正确;包装的病毒载体滴度为4×1010PFU／mL,感染HSC-T6细胞后,Western印迹证实CTGF表达显著减少。结论：构建的腺病毒载体Ad．H1-CTGF可有效抑制HSC-T6中CTGF的表达,为抗纤维化研究提供了有力的工具。     

共表达甲型流感病毒M1和HA双基因的重组腺病毒的构建及鉴定

以我国分离的首株人H5N1亚型禽流感病毒(A/Anhui/1/2005)作为研究对象,通过引入内部核糖体进入位点序列(IRES),构建共表达H5N1亚型禽流感病毒膜蛋白基因M1和HA的重组腺病毒。PCR扩增禽流感病毒H5N1亚型M1和HA基因的全长可读框片段,先后亚克隆入pStar载体,然后扩增M1-IRES-HA片段并将其插入穿梭载体pShuttle-CMV,再与pAd-Easy载体在BJ5183菌中通过同源重组产生重组腺病毒载体,转化293细胞,包装出重组腺病毒Ad-M1/HA。将Ad-M1/HA感染293细胞,可观察到明显细胞病变效应,用免疫荧光及Western-blot方法均检测到M1和HA基因的表达。共表达M1和HA双基因的重组腺病毒的成功构建为开发新型重组腺病毒流感疫苗奠定了基础。     

狂犬病病毒糖蛋白重组人腺病毒的构建及免疫效果的初步研究

构建表达狂犬病病毒弱毒SRV9糖蛋白(GP)的重组人5型腺病毒,检测其对小鼠的免疫效果。将狂犬病病毒SRV9株GP基因的完整开放阅读框克隆到腺病毒表达系统中的穿梭质粒多克隆位点,构建重组穿梭质粒pac-Ad5CMV-Gs9,以罗氏转染液介导线性化骨架质粒和重组穿梭质粒共转染293AD细胞,细胞病变后取培养物进行PCR鉴定并电镜观察,在293AD细胞上测定病毒滴度。以106 TCID50重组腺病毒腹腔接种昆明小鼠,免疫后不同时段采尾静脉血通过荧光抗体病毒中和试验(FAVN)检测小鼠血清狂犬病中和抗体效价。正确构建重组穿梭质粒pacAd5CMV-Gs9;获得表达狂犬病病毒SRV9株GP蛋白的缺陷型重组人5型腺病毒;病毒滴度达到106 CFU/mL以上;腹腔接种小鼠14d后均产生了抗狂犬病中和抗体,有效保护率达90%。成功获得了表达狂犬病病毒GP基因的重组腺病毒,该腺病毒免疫小鼠可产生保护性中和抗体,为进一步开发新型兽用狂犬病疫苗奠定了物质基础。     

串联表达PRRSV M与GP5蛋白重组腺病毒的构建及其免疫特性研究

利用PCR扩增出猪繁殖与呼吸综合征病毒的M基因,按正确的读码框与GP5基因串联,成功构建穿梭载体pShuttle-CMV-M-GP5,经PCR、测序鉴定正确。PmeⅠ线性化后在BJ5183大肠杆菌内与腺病毒骨架载体pAdEasy-1同源重组,产生重组腺病毒DNA。重组腺病毒DNA经PacⅠ线性化后用脂质体转染HEK-293A细胞,在细胞内包装成完整的腺病毒,通过IFA可以检测到M与GP5串联的重组腺病毒构建成功,可以正确地表达目的蛋白。将构建好的重组腺病毒免疫小鼠,结果表明可以诱导产生较强的体液免疫应答(ELISA抗体和中和抗体)和细胞免疫应答(淋巴细胞增殖和CTL反应)。证明该重组腺病毒具有较好的免疫原性,为下一步猪体免疫试验奠定了基础。