低氧诱导因子和角质细胞生长因子双基因重组腺病毒的构建及其在肺泡上皮细胞中的表达

目的：构建同时携带低氧诱导因子-1α（HIF-1α）和角质细胞生长因子（KGF）N腺病毒载体（pAdxsi-GFP-HIF-KGF）,观察其在防治肺损伤潜在的应用前景。方法：低氧处理A549细胞后提取总RNA并逆转录为eDNA作为模板,依据GeneBank公布的HIF-1α cDNA设计引物,并分别引入KpnI和BamHI酶切位点,PCR扩增后将目的基因HIF-1α连接到载体pShuttle-CMV-EGFP上,构建重组质粒pShuttle-GFP—HIF。然后以质粒plRES2-EGFP-KGF为模板,用引入NheI和PmeI酶切位点的引物PCR扩增KGF基因并克隆到重组质粒pShuttle-GFP-HIF上,获得穿梭质粒重组质粒pShuttle—GFP-HIF—KGF。采用细菌内重组方法将目的序列重组到pAdxsi病毒骨架栽体上构建携带HIF．10t和KGF双基因的重组腺病毒载体pAdxsi-GFP-HIF-KGF。检测重组腺病毒滴度后,转染人肺泡上皮细胞A549,检测目的基因的转染表达。结果：通过对构建质粒克隆进行测序及酶切,证实携带HIF—lot和KGF双基因的重组腺病毒载体pAdxsi-GFP-HIF-KGF构建成功,且构建的重组腺病毒纯度好、滴度高。用pAdxsi-GFP-HIF-KGF以100MOI转染A549细胞后24h后在荧光显微镜下可观察到细胞有较强的绿色荧光表达,48h时荧光更强;转染48hELISA法检测培养上清中HIF-1蛋白表达水平为（56．36±4．53）ng／mL,KGF蛋白表达水平为（60．20±2．92）ng／mL。结论：成功构建了腺病毒栽体pAdxsi-GFP-HIF-KGF,其转染效率及目的基因的蛋白表达水平较高,具有潜在的进一步在肺损伤局部应用的前景,为后期制备可以同时发挥KGF、HIF-1作用的基因治疗药物打下基础,同时为高海拔地区应激性急性肺损伤的有效防治提供实验基础。     

CAS和CEA治疗颈内动脉重度狭窄疗效及对脑血流量、血清miR-145、IGF1R的影响

目的:探讨颈动脉支架植入术(CAS)和颈动脉内膜剥脱术(CEA)治疗颈内动脉重度狭窄疗效及对脑血流量、血清miR-145、胰岛素样生长因子1受体(IGF1R)的影响。方法:回顾性分析2018年1月至2019年12月我院收治的100例颈动脉重度狭窄患者的临床资料,按照手术方式不同分为A组和B组,每组50例,A组给予CAS治疗,B组给予CEA治疗。比较两组围术期情况、脑血流量、血清miR-145、IGF1R、简易精神状态检查表(MMSE)量表、蒙特利尔认知评估量表(MoCA)的变化,并比较术后并发症、再狭窄率及死亡率。结果:两组患者手术时间、术中失血量、术后机械通气时间、ICU停留时间、住院时间比较,差异无统计学意义(P>0.05);术后3个月时,两组脑血流量指标相对达峰时间(rTTP)、相对平均通过时间(rMTT)、相对脑血容量(rCBV)、相对脑血流量(rCBE)、血清miR-145、IGF1R、MMSE量表、MoCA量表评分比较差异均无统计学意义(P>0.05);术后30 d内,两组心动过缓、心肌酶谱升高、高灌注综合征、局部血肿、颈动脉急性闭塞比较差异无统计学意义(P>0.05),A组脑卒中、低血压发生率明显高于B组,B组高血压发生率明显高于A组(P<0.05);术后1年时,两组患者死亡率、再狭窄率比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论:CAS和CEA治疗颈内动脉重度狭窄患者的疗效相似,均可有效改善脑血流量,调节血清miR-145、IGF1R水平的表达,促进认知功能恢复,但CAS术后脑卒中、低血压发生率更高,CEA术后高血压发生率更高。