当归多糖对免疫细胞增殖作用的实验研究

探讨当归多糖对免疫细胞的直接和间接作用。用MTT法分别检测当归多糖(PCA)对PBMC的直接作用、PCAPBMC培养液对PBMC的间接作用;用流式细胞术检测PCA作用于健康人PBMC后各种免疫细胞表型的改变;检测PCA注射BALB／c小鼠后脾细胞增殖变化和巨噬细胞的吞噬能力。当归多糖对PBMC具有直接的抑制作用,而当归多糖PBMC培养液可促进PBMC增殖。PCA注射BALB／c小鼠后脾细胞增殖能力和巨噬细胞吞噬能力均得到了不同程度的增强。研究结果为进一步阐明当归多糖的免疫机理提供了理论依据。     

低氧诱导因子和角质细胞生长因子双基因重组腺病毒的构建及其在肺泡上皮细胞中的表达

目的：构建同时携带低氧诱导因子-1α（HIF-1α）和角质细胞生长因子（KGF）N腺病毒载体（pAdxsi-GFP-HIF-KGF）,观察其在防治肺损伤潜在的应用前景。方法：低氧处理A549细胞后提取总RNA并逆转录为eDNA作为模板,依据GeneBank公布的HIF-1α cDNA设计引物,并分别引入KpnI和BamHI酶切位点,PCR扩增后将目的基因HIF-1α连接到载体pShuttle-CMV-EGFP上,构建重组质粒pShuttle-GFP—HIF。然后以质粒plRES2-EGFP-KGF为模板,用引入NheI和PmeI酶切位点的引物PCR扩增KGF基因并克隆到重组质粒pShuttle-GFP-HIF上,获得穿梭质粒重组质粒pShuttle—GFP-HIF—KGF。采用细菌内重组方法将目的序列重组到pAdxsi病毒骨架栽体上构建携带HIF．10t和KGF双基因的重组腺病毒载体pAdxsi-GFP-HIF-KGF。检测重组腺病毒滴度后,转染人肺泡上皮细胞A549,检测目的基因的转染表达。结果：通过对构建质粒克隆进行测序及酶切,证实携带HIF—lot和KGF双基因的重组腺病毒载体pAdxsi-GFP-HIF-KGF构建成功,且构建的重组腺病毒纯度好、滴度高。用pAdxsi-GFP-HIF-KGF以100MOI转染A549细胞后24h后在荧光显微镜下可观察到细胞有较强的绿色荧光表达,48h时荧光更强;转染48hELISA法检测培养上清中HIF-1蛋白表达水平为（56．36±4．53）ng／mL,KGF蛋白表达水平为（60．20±2．92）ng／mL。结论：成功构建了腺病毒栽体pAdxsi-GFP-HIF-KGF,其转染效率及目的基因的蛋白表达水平较高,具有潜在的进一步在肺损伤局部应用的前景,为后期制备可以同时发挥KGF、HIF-1作用的基因治疗药物打下基础,同时为高海拔地区应激性急性肺损伤的有效防治提供实验基础。     

电转染效率影响因素的探讨

目的:探讨影响电转染效率的因素。方法:将CHO细胞和DNA(携带标志基因的质粒)混和后进行电转染,观察电转染前孵育温度、渗透压、电转染参数、细胞周期等对细胞存活率和电转染效率影响。结果:孵育温度不影响细胞的存活率,而影响基因的转染效率;电转染前后低渗条件有利于电转染;延长电转染持续时间和频率而不加大电压有利于电转染;最好选用处于G2/M期的细胞进行电转染。结论:初步认为温度、渗透压、电转染参数、细胞周期等对细胞存活率和电转染效率有一定的影响。