淡色库蚊中抗性相关羧酸酯酶的纯化及其生化性质

在库蚊Culex pipiens品系中,非专一性酯酶活性的升高是对有机磷杀虫剂产生抗性的重要机理之一。应用SDS/PAGE,比较淡色库蚊Culex pipiens pallens抗敌百虫品系(RD)、敏感型品系(S)和抗苄呋菊酯品系(PY)中可溶性总蛋白质带型,显示RD中含有一条特异蛋白带,其它两个品系中未检出。在RD成虫匀浆液总蛋白中含量高达2.1%。分子量测定为66 kD。应用柱层析法分离得到了较纯的纯品。以α-NA为底物测得K_m=64.1 mmol/L,V_max=249.8 mmol/(L·mg·min)。与羧酸酯酶相比较：其K_m值小于已报道的抗性品系及非抗性品系A-酯酶和B-酯酶。V_max值比已报道抗性品系A-酯酶低,比B-酯酶高。较高浓度的敌百虫并不能抑制其酶活,属于A-酯酶。在昆虫体内可能主要通过结合隔离作用(sequestration)提高昆虫对有机磷的耐受性,对有机磷杀虫剂水解作用的可能性也不能排除。     

粘虫中肠α-淀粉酶活性的敏感性研究

研究了不同酶反应缓冲体系、pH值、氯离子浓度以及噁唑哒嗪对5龄2日粘虫 Pseudaletia separata Walker 中肠α－淀粉酶活性的影响。结果表明,乙酸-乙酸钠缓冲体系（pH 5.8）和磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲体系（pH 8.0）有利于增强α-淀粉酶活性,比活力最高分别达到4.49和4.97。在乙酸-乙酸钠缓冲体系（pH 5.8）中,5、10、20、40和80 mmol/L氯离子浓度引起α-淀粉酶活性呈现先减弱后增强的变化规律,而在磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲体系（pH 8.0）中仅呈现减弱的趋势。1.4 mmol/L噁唑哒嗪对α-淀粉酶活性的抑制率可达70%,但抑制程度随着反应体系中蛋白含量的增加而逐渐降低。     

新型含硅氨基甲酸酯衍生物的合成、杀虫活性及抗乙酰胆碱酯酶活性研究

合成了14个(1-甲硫基亚乙基)氨基甲基氨基甲酸酯(灭多威)1的新型含硅衍生物3。 测定了其杀虫活性和抗乙酰胆碱酯酶活性。结桌表明该类化合物具有很好的杀虫活性,在50μg/mL浓度下,对粘虫Mythimna separata Walker几乎全部具有100%杀灭效果。以美洲大蠊Periplaneta americana为试材,大部分化合物的抗乙酰胆碱酯酶活性与母体灭多威1相当     

四种蜚蠊的呼吸信号特征比较

在20℃下,利用CO₂红外分析仪采集了美洲大蠊Periplaneta americana、褐斑大蠊P.brunnea、澳洲大蠊P.australasiae和德国小蠊Blattella germanica的呼吸信号。结果表明,它们均具有典型的不连续气体交换循环（discontinuous gas exchange cycle, DGC）呼吸模式,且一个DGC可分为爆发间期和爆发期2个阶段。4种蜚蠊雄性成虫DGC的特征各异：美洲大蠊完成一个DGC周期平均约需24.55 min,明显长于褐斑大蠊(11.67 min)和澳洲大蠊(10.75 min),德国小蠊周期最短,仅为4.41 min;对于爆发间期历时在整个DGC历时所占的比例,美洲大蠊最大,平均为57％,德国小蠊次之,为48％,褐斑大蠊和澳洲大蠊比较接近,分别为37％和36％。德国小蠊单位体重的CO₂平均释放速率最大,而另外3种蜚蠊的差异不明显。4种蜚蠊爆发期CO₂释放体积均随DGC历时增加而增加,美洲大蠊和德国小蠊单位体重的CO₂平均释放率随DGC历时增加而减少,在褐斑大蠊和澳洲大蠊中它们关系不明显。美洲大蠊、褐斑大蠊和澳洲大蠊CO₂平均释放率和爆发期CO₂释放体积与体重呈正相关,在德国小蠊中关系不明显;4种蜚蠊DGC各阶段历时和DGC频率与它们体重的关系均不明显。     

杠柳杀虫组分F3-28对东方粘虫和小地老虎幼虫中肠消化酶活性的影响

F3-28是从杀虫植物杠柳Periploca sepium Bunge根皮中分离的一个具有杀虫活性的馏分,其主要成分为杠柳苷A、杠柳苷E和杠柳苷X。为了探索F3-28的初始作用部位, 为深入研究其作用机理奠定基础, 本研究采用经典的昆虫消化酶活性测定方法, 比较了F3-28对小地老虎Agrotis ypsilon和东方粘虫Mythimna separata 5龄幼虫消化酶系活性的影响。结果表明：对F3-28不敏感的小地老虎幼虫摄食F3-28后,其中肠蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶的活性无显著变化。对F3-28敏感的东方粘虫幼虫摄食F3-28后2,4,8,10,12,24,48 h, 其中肠总蛋白酶活性分别为对照组的0.76,2.53,1.45,1.88,1.54,1.46,1.70倍,且和药物浓度呈依赖关系; 类胰蛋白酶的活性分别为对照组的1.60, 1.75,1.60,1.12,1.39,1.16,1.15倍（以BAPNA为底物）或1.68,1.95,1.53,1.26,1.15,1.13,1.14倍（以TAME为底物）,且和药物浓度呈依赖关系; 类胰凝乳蛋白酶活性分别为对照组的0.50,1.66,1.44,1.18,1.54,1.08和1.03 倍,但和药物浓度无依赖关系; 淀粉酶的活性分别为对照组的1.60,1.35,1.27,1.31,1.23和1.20 倍,但和药物浓度无依赖关系;对脂肪酶活性无明显影响。这些结果说明,杠柳杀虫活性组分F3-28的作用机理可能涉及对试虫中肠蛋白酶的激活,特别是对类胰蛋白酶的激活。     

淡色库蚊酯酶等位基因及其在自然种群中的频率分布

酯酶基因扩增所产生的酯酶活性升高是库蚊Culex pipiens对有机磷杀虫剂抗性的主要机理之一。采用分子杂交技术和限制性酶切片段长度多态性(RFLP)分析,已鉴定出多种酯酶等位基因类型。该文通过酯酶基因特异性片段的PCR扩增及扩增片段的酶切片段分析,对淡色库蚊Culex pipiens pallens四种有机磷抗性品系的酯酶等位基因进行分型,并测定分析自然种群中不同酶型的频率分布。研究结果表明：PCR分型方法具有快速、准确的特点。不同的有机磷杀虫剂对酯酶等位基因具有明显的选择作用。双硫磷品系为B₁型;毒死蜱和敌百虫品系为B₂型;马拉硫磷品系为B₁型和B₁/B₂杂合型。不同地区采集的种群表现出不同的酶型频率分布。该文就杀虫剂对酯酶等位基因选择作用及自然种群的酶型频率分布进行了讨论。     

苦皮藤素V对东方粘虫中肠细胞及其消化酶活性的影响

苦皮藤素V是从杀虫植物苦皮藤Celastrus angulatus Max.根皮中分离的一种对昆虫具有毒杀活性的新化合物。该文通过电镜观察和生化分析研究了其对东方粘虫Mythimnaseparata(walker)幼虫中肠组织及中肠主要消化酶活性的影响。电镜观察发现,中毒试虫的中肠细胞及其细胞器发生明显病变：柱状细胞顶膜微绒毛零乱、减少;线粒体肿胀,出现空白亮区,双层膜不完整;细胞质密度降低,细胞器排列紊乱;内质网池扩张,囊泡化,粗面内质网减少;杯状细胞杯腔变大,微绒毛减少。消化酶活性测定结果表明,中毒试虫中肠的蛋白酶、淀粉酶及脂肪酶的活性和正常虫相比,无显著变化。因此认为,苦皮藤素V主要作用于中肠细胞的质膜及其内膜系统。     

从华蟹甲草中分离的两种活性成分对家蝇的杀虫活性

研究了从我国特有植物华蟹甲草Sinacalia tangutica (Maxim.) B. Nord中经生物活性跟踪实验得出的杀虫活性成分Z,Z,Z-9,12,15-十八碳三烯酸和Z,Z-9,12-十八碳二烯酸对家蝇Musca domestica vicina的生物活性及对其生理生化指标的影响。结果表明,家蝇经该2种化合物1 mg/mL处理后表现出类似神经毒剂中毒的兴奋症状。这2种化合物对家蝇表现出毒杀作用,24 h时,Z,Z,Z-9,12,15-十八碳三烯酸和Z,Z-9,12-十八碳二烯酸对家蝇的LC₅₀值分别为0.26 mg/mL和0.43 mg/mL; 对家蝇触杀作用极低,以1 mg/mL分别点滴处理家蝇后48 h,死亡率分别为21.54%和4.08%。这2种化合物对家蝇的AChE影响不明显,但可引起家蝇的过氧化物酶的活性发生紊乱,对家蝇总糖含量也有一定的影响。Z,Z-9,12-十八碳二烯酸可引起家蝇的Mg-ATPase的比活力降低,而Z,Z,Z-9,12,15-十八碳三烯酸引起家蝇的Na-K-Mg-ATPase和Ca-ATPase的比活力较对照上升。     

昆虫神经毒素BjαIT的表达及杀虫活性

根据毕赤酵母Pichia pastoris密码子偏爱性,不改变毒素蛋白质一级结构,设计合成了昆虫神经毒素BjαIT基因,并分别克隆至大肠杆菌Escherichia coli融合表达载体pPET30-a(+)和毕赤酵母分泌表达载体pPIC9K。在IPTG的诱导下,神经毒素在大肠杆菌中融合表达,表达产物利用镍亲和层析柱纯化,纯化产物用于制备抗血清和活性测试。采用斑点杂交,筛选得到了较高水平分泌表达重组BjαIT的酵母转化子,摇瓶条件下,毒素表达量最大可达约20 mg/L。大肠杆菌BjαIT表达产物对东亚飞蝗Locusta migratoria manilensis和德国小蠊Blattela germanica没有活性,但酵母表达产物经注射东亚飞蝗和德国小蠊表现出杀虫活性。     

苏云金杆菌预处理小菜蛾对有机磷和氨基甲酸酯杀虫剂的增效作用

研究了小菜蛾Plutella xylostella幼虫经苏云金杆菌Bacillus thuringiensis预处理后,对有机磷和氨基甲酸酯杀虫剂敏感性的变化以及预处理对小菜蛾幼虫体内乙酰胆碱酯酶、羧酸酯酶、谷胱甘肽S-转移酶和谷胱甘肽的含量的影响。结果表明：苏云金杆菌预处理抗性小菜蛾幼虫后,其对甲胺磷、水胺硫磷和克百威的敏感性分别为未处理组的6.74、8.83和8.50倍;处理敏感小菜蛾幼虫后则分别为未处理组的2.96、1.69和3.88倍。苏云金杆菌预处理抗性小菜蛾,未处理组乙酰胆碱酯酶的K_m和V_max值分别为预处理组的1.86和1.56倍,所使用的6种杀虫剂对乙酰胆碱酯酶的K_I值,处理组为未处理组的1.80～2.66倍,苏云金杆菌预处理抗性小菜蛾对羧酸酯酶的K_m、K_I影响不大,但能显著地抑制羧酸酯酶和谷胱甘肽S-转移酶的活性并导致谷胱甘肽含量下降(对照分别为处理的2.02、1.76和1.66倍)。苏云金杆菌预处理敏感小菜蛾,对乙酰胆碱酯酶的K_m、V_max、K_I值和羧酸酯酶的K_m、K_I值以及谷胱甘肽含量影响不大,但能显著地抑制羧酸酯酶和谷胱甘肽S-转移酶的活性(对照分别为处理的1.54和1.64倍)。     

有机磷对抗拟除虫菊酯家蝇的毒力

测定敏感、抗溴氰菊酯(Del-R)、抗氯菊酯(2Cl-R)的家蝇品系对有机磷杀虫剂敌敌畏、辛硫磷及马拉硫磷的LD₅₀,α-乙酸萘酯（α-NA）酯酶动力学,酯酶的活性和酯酶的抑制作用。Del-R和2Cl-R的家蝇品系对三种有机磷杀虫剂的抗性倍数为0.966～7.190倍,均为低抗水平。三个家蝇品系的羧酸酯酶活性水平与抑制中浓度存在正相关性,说明羧酸酯酶在抗拟除虫菊酯家蝇对有机磷杀虫剂的抗性中起一定的作用。     

星天牛幼虫肠道木聚糖酶的纯化和性质

星天牛Anoplophora chinensis (Frster)幼虫肠道匀浆液经80%丙酮沉淀、Q-Sepharose阴离子交换柱层析、PAGE制备电泳等方法纯化后,获得在SDS-PAGE上呈现单一区带的木聚糖酶。该酶的分子量约25 kD,等电点约4.0,最适温度50℃,最适pH 5.4,pH 3.0～7.8对酶活性的恢复无大的影响, 50℃保温2 h仍有60%酶活性。Hg²⁺、M_nO^-4、变性剂SDS完全抑制该酶活性, Cu²⁺、Mn²⁺、Ag⁺、Zn²⁺、Pb⁺、脲对酶活性有强烈的抑制作用。该酶具有水解纤维素的交叉活性,其K_m值为2.47 mg/mL,V_max为0.6 IU/mL。     

Effects of periplocosides P and E from Periploca sepium on the proteinase activities in the midgut of larvae of Mythimna separata and Agrotis ypsilon ( Lepidoptera: Noctuidae)

从杀虫植物杠柳Periploca sepiutm Bunge根皮中分离得到的杠柳新苷P具有很高的杀虫活性,为了探索其杀虫机理,采用经典的昆虫蛋白酶活性测定方法,比较研究了杠柳新苷P和无杀虫活性的杠柳新苷E对东方粘虫Mythimna separata与小地老虎Agrotis ypsilon 6龄幼虫中肠类胰蛋白酶和类胰凝乳蛋白酶活性的影响.结果表明:对东方粘虫弱碱性类胰蛋白酶,杠柳新苷P表现出强激活作用(酶活性为对照的3.43倍),激活时间可长达8h,而杠柳新苷E则无明显激活作用.杠柳新苷P和E对东方粘虫弱碱性类胰蛋白酶活性的影响二者差异显著(P=0.01),杠柳新苷P药后2,4和8h,东方粘虫中肠弱碱性类胰蛋白酶的活性分别是杠柳新苷E药后的15.4,106.8和242.7倍.酶活性测定结果还表明,与东方粘虫相比,小地老虎中肠类胰蛋白酶活性相对较低,且杠柳新苷P的激活作用也较弱,这可能是杠柳新苷P对东方粘虫具杀虫活性,而小地老虎对其不敏感的原因之一;另外,杠柳新苷P和E对试虫中肠类凝乳胰蛋白酶活性均无明显影响.据此推测,杠柳活性成分新苷P对东方粘虫中肠弱碱性类胰蛋白酶的激活作用可能是造成试虫中毒的机理之一.     

杠柳新苷P和E对东方粘虫和小地老虎幼虫中肠蛋白酶活性的影响

从杀虫植物杠柳Periploca sepium Bunge根皮中分离得到的杠柳新苷P具有很高的杀虫活性, 为了探索其杀虫机理, 采用经典的昆虫蛋白酶活性测定方法, 比较研究了杠柳新苷P和无杀虫活性的杠柳新苷E对东方粘虫Mythimna separata与小地老虎Agrotis ypsilon 6龄幼虫中肠类胰蛋白酶和类胰凝乳蛋白酶活性的影响。结果表明： 对东方粘虫弱碱性类胰蛋白酶, 杠柳新苷P表现出强激活作用（酶活性为对照的3.43倍）, 激活时间可长达8 h, 而杠柳新苷E则无明显激活作用。杠柳新苷P和E对东方粘虫弱碱性类胰蛋白酶活性的影响二者差异显著（P=0.01）, 杠柳新苷P药后2, 4和8 h, 东方粘虫中肠弱碱性类胰蛋白酶的活性分别是杠柳新苷E药后的15.4, 106.8和242.7倍。酶活性测定结果还表明, 与东方粘虫相比, 小地老虎中肠类胰蛋白酶活性相对较低, 且杠柳新苷P的激活作用也较弱, 这可能是杠柳新苷P对东方粘虫具杀虫活性, 而小地老虎对其不敏感的原因之一; 另外, 杠柳新苷P和E对试虫中肠类凝乳胰蛋白酶活性均无明显影响。据此推测, 杠柳活性成分新苷P对东方粘虫中肠弱碱性类胰蛋白酶的激活作用可能是造成试虫中毒的机理之一。     

松油烯-４-醇对粘虫幼虫的生物活性

测定了杀虫植物砂地柏Sabina vulgaris Ant.的精油中主杀虫成分-松油烯-4-醇（terpinen 4.01）对粘虫Mythimna separata Walker幼虫的生物活性。结果表明,松油烯- 4-醇对粘虫主要表现为熏蒸作用,对粘虫3龄幼虫24 h的熏蒸LC₅₀为5.3473 μL/L ;还具一定触杀作用,对粘虫4龄幼虫24 h的LD₅₀为147.8 μg/虫。试虫的中毒症状可明显地分为兴奋、痉挛、麻痹和死亡4个阶段,而麻痹的部分试虫有复苏现象。可明显抑制Na⁺ ,K⁺ATP酶的活性,在兴奋期、痉挛期、麻痹期和复苏期,抑制率介于21.28%～34.92% 之间。离体条件下对Na⁺,K⁺ATP酶的I₅₀为133.75 μg·mL^-1;对AChE活性有一定的影响;对酯酶,在兴奋期,酶活力为对照的7.0%,在麻痹期则为对照的1.33倍,而复苏期试虫的酯酶活力与对照相当。     

中华稻蝗两地理种群酯酶特性的比较研究

对采自江苏徐州和山西临猗两个种群中华稻蝗进行了马拉硫磷敏感性的生物测定,同时对两个种群的酯酶特性进行了比较研究。生物测定结果表明,徐州种群的LD₅₀值（13.00 μg/g虫重）是临猗种群（4.64 μg/g虫重）的2.8倍;用对氧磷、马拉氧磷、西维因及毒扁豆碱等四种抑制剂对该两个种群的酯酶的体外抑制研究表明,两个种群所含酯酶大都为B型酯酶;酯酶动力学研究结果表明,徐州种群动力学参数米氏常数（K_m值）和最大反应速度（V_max值）均较临猗种群为高;用α-乙酸萘酯（α-NA）、α-丁酸萘酯（α-NB）和β-乙酸萘酯（β-NA）三种底物测定酯酶活性,在雌性稻蝗中,徐州种群比临猗种群分别高2.02、1.58和1.28倍,雄性中则分别高2.71、1.67和1.33倍;对两个种群酯酶活性频率分布进行比较,徐州种群中酯酶活性高的个体数远大于临猗种群。我们推测徐州种群酯酶的生化特性可能不同于临猗种群,这可能与地理分布、生态环境和食物条件不同有关,杀虫剂选择压力不同可能也起一定的作用。     

棉铃虫幼虫中肠微粒体P450差光谱与O-脱甲基酶的酶学特征及其可诱导性

棉铃虫Helicoverpa armigera (Hübner)幼虫中肠微粒体制备液的CO差光谱在450 nm有吸收峰,P450含量为(687±11) pmol/mg。中肠750 g离心的上清液的O-脱甲基酶活性在酶量相当5个中肠、反应时间30 min内与酶量和反应时间呈线性关系;最适Ph值在7.8, 最适温度为20～25℃。酶系对底物对硝基苯甲醚的O-脱甲基活性的Km=1.23 mmol/L, V_max=2.54 nmol对硝基酚/(mg·min)。NADPH为酶活的重要因子,离体测定时,O-脱甲基酶在无外来NADPH的活性仅为加0.25 mmol/L NADPH 的16%。在反应体系中加入1.5% BSA明显促进产物的生成。P450的专一性抑制剂PBO浓度达到1 mmol/L时,可抑制酶90%的活性。棉铃虫取食含0.25%苯巴比妥钠的食物72 h后,O-脱甲基酶活性是对照组的1.73倍。     

昆明山海棠的杀虫活性及有效成分

【目的】从天然产物尤其是植物中寻找杀虫活性物质是杀虫剂创制的重要途径。【方法】采用生物活性追踪、分离等方法,研究了昆明山海棠Tripterygium hypoglaucum (Levl.) Hutch对6种鳞翅目昆虫的杀虫活性及有效成分。【结果】昆明山海棠根皮石油醚提取物、甲醇提取物和乙酸乙酯提取物对粘虫3龄幼虫均具有拒食活性,24 h的拒食毒力AFC₅₀值分别为1 165.7 μg/mL、104.3 μg/mL和 47.3 μg/mL。昆明山海棠根皮甲醇提取物对粘虫4龄幼虫具有触杀活性,其LD₅₀值为100.4 μg/头。从昆明山海棠根皮甲醇提取物中分离出雷公藤春碱、雷公藤吉碱、雷公藤定碱和雷公藤榕碱 4个杀虫活性化合物,雷公藤春碱和雷公藤吉碱对粘虫具有胃毒麻醉活性,对粘虫3龄幼虫8 h的麻醉中量（ND₅₀）分别是18.1 μg/头和7.4 μg/头。雷公藤定碱和雷公藤榕碱对粘虫具有触杀麻醉活性,对粘虫4龄幼虫24 h的ND₅₀分别是0.33 μg/头和0.06 μg/头;对3龄小地老虎具有胃毒麻醉活性,24 h的麻醉中量ND₅₀分别是5.62 μg/头和1.24 μg/头。【结论】昆明山海棠对所测试的6种鳞翅目昆虫均有一定的杀虫活性,其主要杀虫活性成分为雷公藤春碱、雷公藤吉碱、雷公藤定碱和雷公藤榕碱4个化合物。     

菜蚜茧蜂对甲胺磷和灭多威的抗性机制

采用试管药膜法测定了菜蚜茧蜂 Diaeretiella rapae 对甲胺磷和灭多威的抗性及增效剂的增效作用,并测定了菜蚜茧蜂和菜缢管蚜 Lipaphis erysimi 乙酰胆碱酯酶动力学参数、解毒酶活性及增效剂对菜蚜茧蜂酶活性的体内抑制作用。福州地区菜蚜茧蜂已对甲胺磷和灭多威产生5.6和9.1倍的抗性,胡椒基丁醚、磷酸三苯酯和马来酸二乙酯对两种杀虫剂的抗性品系均有显著增效作用,胡椒基丁醚的作用最为显著。胡椒基丁醚对抗性菜蚜茧蜂杀虫剂敏感性的增效作用远高于对敏感菜蚜茧蜂的影响。3种增效剂对菜蚜茧蜂乙酰胆碱酯酶均无抑制作用;磷酸三苯酯和胡椒基丁醚对羧酸酯酶,马来酸二乙酯对谷胱甘肽S转移酶有显著抑制作用。抗性和敏感菜蚜茧蜂乙酰胆碱酯酶的米氏常数K_m）、最大反应速度（V_max）、羧酸酯酶及谷胱甘肽S转移酶活性值相近,但敏感菜蚜茧蜂乙酰胆碱酯酶的双分子速度常数（K_I）值远高于抗性的。此外,对菜蚜茧蜂和菜缢管蚜乙酰胆碱酯酶、羧酸酯酶和谷胱甘肽S转移酶进行了比较研究。结果表明菜蚜茧蜂对甲胺磷和灭多威的低水平抗性与乙酰胆碱酯酶的不敏感性及解毒酶的解毒代谢有关。     

中国大麦地方品种的α-淀粉酶酶活性研究

为了研究中国大麦地方品种种质资源α-淀粉酶的遗传变异,发掘具有高α-淀粉酶酶活性的材料。本试验以257份中国地方品种为试验材料,利用3,5-二硝基水杨酸法(DNS)和降落数值法(FN)测定了2010年和2011年收获的发芽种子与干种子中的α-淀粉酶活性。分析了不同年份间及发芽种子与干种子中的酶活性的相关性。结果表明,中国大麦地方品种的α-淀粉酶酶活性存在广泛的遗传变异,酶活性最高的品种几乎是酶活性最低品种的4倍,且多数品种的α-淀粉酶活性在发芽后第5天或第6天达到最高。发芽种子的α-淀粉酶酶活性在年份之间的相关性达到极显著水平,说明发芽种子的α-淀粉酶酶活性主要受遗传因素控制;发芽种子与干种子的酶活性之间相关性不显著,表明干种子测定的降落数值不能用来预测大麦品种的α-淀粉酶活性。