Effects of periplocosides P and E from Periploca sepium on the proteinase activities in the midgut of larvae of Mythimna separata and Agrotis ypsilon ( Lepidoptera: Noctuidae)

从杀虫植物杠柳Periploca sepiutm Bunge根皮中分离得到的杠柳新苷P具有很高的杀虫活性,为了探索其杀虫机理,采用经典的昆虫蛋白酶活性测定方法,比较研究了杠柳新苷P和无杀虫活性的杠柳新苷E对东方粘虫Mythimna separata与小地老虎Agrotis ypsilon 6龄幼虫中肠类胰蛋白酶和类胰凝乳蛋白酶活性的影响.结果表明:对东方粘虫弱碱性类胰蛋白酶,杠柳新苷P表现出强激活作用(酶活性为对照的3.43倍),激活时间可长达8h,而杠柳新苷E则无明显激活作用.杠柳新苷P和E对东方粘虫弱碱性类胰蛋白酶活性的影响二者差异显著(P=0.01),杠柳新苷P药后2,4和8h,东方粘虫中肠弱碱性类胰蛋白酶的活性分别是杠柳新苷E药后的15.4,106.8和242.7倍.酶活性测定结果还表明,与东方粘虫相比,小地老虎中肠类胰蛋白酶活性相对较低,且杠柳新苷P的激活作用也较弱,这可能是杠柳新苷P对东方粘虫具杀虫活性,而小地老虎对其不敏感的原因之一;另外,杠柳新苷P和E对试虫中肠类凝乳胰蛋白酶活性均无明显影响.据此推测,杠柳活性成分新苷P对东方粘虫中肠弱碱性类胰蛋白酶的激活作用可能是造成试虫中毒的机理之一.     

杠柳杀虫组分F3-28对东方粘虫和小地老虎幼虫中肠消化酶活性的影响

F3-28是从杀虫植物杠柳Periploca sepium Bunge根皮中分离的一个具有杀虫活性的馏分,其主要成分为杠柳苷A、杠柳苷E和杠柳苷X。为了探索F3-28的初始作用部位, 为深入研究其作用机理奠定基础, 本研究采用经典的昆虫消化酶活性测定方法, 比较了F3-28对小地老虎Agrotis ypsilon和东方粘虫Mythimna separata 5龄幼虫消化酶系活性的影响。结果表明：对F3-28不敏感的小地老虎幼虫摄食F3-28后,其中肠蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶的活性无显著变化。对F3-28敏感的东方粘虫幼虫摄食F3-28后2,4,8,10,12,24,48 h, 其中肠总蛋白酶活性分别为对照组的0.76,2.53,1.45,1.88,1.54,1.46,1.70倍,且和药物浓度呈依赖关系; 类胰蛋白酶的活性分别为对照组的1.60, 1.75,1.60,1.12,1.39,1.16,1.15倍（以BAPNA为底物）或1.68,1.95,1.53,1.26,1.15,1.13,1.14倍（以TAME为底物）,且和药物浓度呈依赖关系; 类胰凝乳蛋白酶活性分别为对照组的0.50,1.66,1.44,1.18,1.54,1.08和1.03 倍,但和药物浓度无依赖关系; 淀粉酶的活性分别为对照组的1.60,1.35,1.27,1.31,1.23和1.20 倍,但和药物浓度无依赖关系;对脂肪酶活性无明显影响。这些结果说明,杠柳杀虫活性组分F3-28的作用机理可能涉及对试虫中肠蛋白酶的激活,特别是对类胰蛋白酶的激活。     

杠柳毒素NW的杀虫活性

杠柳毒素NW是从杠柳(Periploca sepium Bunge)中分离的新化合物,是其主要的杀虫成分。对杠柳毒素NW的杀虫活性进行了测定,结果表明:杠柳毒素NW对小地老虎无明显的胃毒活性,对3龄的小菜蛾、粘虫和菜粉蝶幼虫均有较强的胃毒活性,处理后24h的致死中浓(LC50)分别是866.17,927.92和1107.08mg·L-1;对上述供试昆虫均无明显的触杀活性。此外,杠柳毒素NW对棉蚜、棉红蜘蛛及卫生害虫家蝇3龄幼虫和淡色库蚊3龄幼虫均有很好的毒杀活性,处理后24h的LC50分别为1743.17,2179.49,714.94和653.29mg·L-1。     

苦皮藤素V对东方粘虫中肠细胞及其消化酶活性的影响

苦皮藤素V是从杀虫植物苦皮藤Celastrus angulatus Max.根皮中分离的一种对昆虫具有毒杀活性的新化合物。该文通过电镜观察和生化分析研究了其对东方粘虫Mythimnaseparata(walker)幼虫中肠组织及中肠主要消化酶活性的影响。电镜观察发现,中毒试虫的中肠细胞及其细胞器发生明显病变：柱状细胞顶膜微绒毛零乱、减少;线粒体肿胀,出现空白亮区,双层膜不完整;细胞质密度降低,细胞器排列紊乱;内质网池扩张,囊泡化,粗面内质网减少;杯状细胞杯腔变大,微绒毛减少。消化酶活性测定结果表明,中毒试虫中肠的蛋白酶、淀粉酶及脂肪酶的活性和正常虫相比,无显著变化。因此认为,苦皮藤素V主要作用于中肠细胞的质膜及其内膜系统。     

棉铃虫幼虫中肠主要蛋白酶活性的鉴定

根据棉铃虫Helicoverpa armigera(Hubner)中肠酶液对蛋白酶专性底物在不同pH下的水解作用,棉铃虫中肠的3种丝氨酸蛋白酶得到鉴定。它们是：强碱性类胰蛋白酶,水 解a-N-苯甲酰-DL-精氨酸-p-硝基苯胺的最适pH在10.50以上;弱碱性类胰蛋白酶,水解p-甲苯磺酰-L-精氨酸甲酯的最适pH为8.50～9.00;类胰凝乳蛋白酶, 水解N一苯甲酰-L-酪氨酸乙酯的最适pH亦为8.50-9.00。中肠总蛋白酶活性用偶 氮酪蛋白测定,最适pH亦在10.50以上。Ca²⁺对昆虫蛋白酶无影响,Mg²⁺仅对弱碱性类胰蛋白酶有激活作用。对苯甲基磺酰氟和甲基磺酰-L-赖氨酸氯甲基酮对弱碱性类胰蛋白酶的抑制作用较强,而对强碱性类胰蛋白酶的抑制作用较弱。甲基磺酰-L苯丙氨酸氯甲基酮除能抑制类胰凝乳蛋白酶外,还能激活弱碱性类胰蛋白酶。对牛胰蛋白酶有强抑制作用的卵粘蛋白抑制剂对昆虫蛋白酶却无抑制作用。大豆胰蛋白酶抑制剂对该虫的3种丝氨酸蛋白酶均有强的抑制作用。     

Cry1Ac杀虫蛋白对粘虫中肠几种酶活性的影响

为阐明Bt杀虫蛋白对次要靶标害虫粘虫Mythimna separata (Walker) （鳞翅目： 夜蛾科）的生理学影响, 本研究分析比较了粘虫高龄幼虫在室内取食低剂量Cry1Ac杀虫蛋白6, 12, 24和36 h后, 其体内主要的解毒酶（酯酶和谷胱甘肽-S-转移酶）、 保护酶（超氧化物歧化酶、 过氧化氢酶和过氧化物酶）和中肠蛋白酶（总蛋白酶、 强碱性类胰蛋白酶、 弱碱性类胰蛋白酶和类胰凝乳蛋白酶）等活性的变化。结果表明, 取食Cry1Ac杀虫蛋白后, 粘虫幼虫体内相关酶活力呈现不同的变化趋势： （1）酯酶、 谷胱甘肽-S-转移酶、 过氧化物酶(POD)、 类胰蛋白酶和类胰凝乳蛋白酶活力较对照显著降低（P<0.05）; （2）超氧化物歧化酶(SOD) 活力较对照显著升高（P<0.05）; （3）过氧化氢酶(CAT) 活力于6, 12和24 h显著低于对照（P<0.05）, 36 h时显著高于对照（P<0.05）。结果提示Cry1Ac杀虫蛋白主要通过抑制粘虫幼虫中肠解毒酶和蛋白酶的活性, 扰乱SOD, CAT 和POD 3种保护酶的动态平衡而干扰幼虫的正常生理代谢, 从而起到毒杀粘虫的作用。     

斑蝥素类衍生物对粘虫胃毒活性及解毒酶系的影响

【目的】筛选斑蝥素衍生物,寻找高效、低毒、低残留的新型化合物研发杀虫剂。【方法】采用生物测定和酶活性测定方法,对100种斑蝥素类衍生物进行筛选,采用叶碟饲喂法测定其对粘虫3龄幼虫的胃毒活性;测定亚致死剂量下试虫体内解毒酶系的活性变化。【结果】通过生物测定发现斑蝥素衍生物Ⅰ-7~#和Ⅳ-13~#的杀虫活性优于去甲斑蝥素,Ⅰ-7~#与斑蝥素对粘虫的胃毒LC_(50)值相近,其LC_(50)分别为49.818mg/m L和43.677mg/m L。酶活性测定结果表明:斑蝥素、斑蝥素衍生物去甲斑蝥素、Ⅰ-7~#和Ⅳ-13~#对粘虫解毒酶系酶比活力均有不同程度的影响,其中对细胞色素P450酶比活力有明显的抑制活性,对羧酸酯酶比活力有不同程度的激活作用,而对谷胱甘肽S-转移酶比活力大体表现出先激活后抑制的活性。【结论】斑蝥素衍生物Ⅰ-7~#和Ⅳ-13~#对鳞翅目害虫有较强杀虫活性,具有作为生物源农药加以开发利用的价值。     

小地老虎及粘虫幼虫对灭幼脲表现自然耐药力的体壁结构和生化基础

小地老虎Agrotis ypsilon rottem.幼虫对灭幼脲具有一定的自然耐药力。本文以粘虫Mythimna separata(Walker)作为敏感性虫种与之进行比较,实验结果表明,灭幼脲对两种试虫的室内毒力相差4倍左右,引起差异的原因,在体壁结构方面主要在于:(1)小地老虎幼虫的表皮层较粘虫的厚4.2倍左右;(2)上表皮不是匀质结构,依靠少数蜡道与体表沟通;(3)几丁质片层内的孔道数较少,仅及粘虫的1/4。由此构成了表皮对疏水性的灭幼脲表现抗穿透的性能。小地老虎幼虫体壁还含有较强的生化防卫体系,灭幼脲对多功能氧化酶、芳基酰胺酶有明显激活效应,这两种酶都是灭幼脲的降解酶。由此认为,小地老虎幼虫对灭幼脲所表现的自然耐药力,是由体壁的抗穿透性能以及由灭幼脲所激活的适应酶所造成。     

马桑内酯对粘虫幼虫体内3种酶活性的影响

采用3种马桑内酯——羟基马桑毒素、马桑亭和马桑宁饲喂和注射粘虫幼虫,测定和分析了虫体组织中乙酰胆碱酯酶(AChE)、谷胱甘肽S-转移酶(GST)和多酚氧化酶(PPO)活性变化.结果表明,3种马桑内酯对试虫体内乙酰胆碱酯酶活性的影响存在差异,在4~48 h大多时间段具有激活特性;而谷胱甘肽S-转移酶的活性或被激活或被抑制,饲喂用药后4~8 h中肠组织中酶被激活,12 h酶活性被抑制,整个过程呈现S型;多酚氧化酶活性受3种毒素的影响不明显.     

pH对红褐斑腿蝗中肠主要蛋白酶活性的影响

为评价pH对红褐斑腿蝗Catantops pinguis (Stål)中肠蛋白酶活性的影响, 本文用3种专性底物测定了不同pH环境下蝗虫中肠类胰蛋白酶和类胰凝乳蛋白酶的活性。结果表明: 雄性红褐斑腿蝗中肠肠液的pH值为6.92±0.043, 雌性为7.03±0.054, 两性间差异不显著（P>0.05）。并且发现3种蛋白酶的最适pH值各不相同, 其中雌雄虫的强碱性类胰蛋白酶（以BAPNA为底物）最适pH分别为8.5和10.5; 雌雄虫的弱碱性类胰蛋白酶（以TAME为底物）最适pH分别为9.0和9.5; 而雌雄虫的类胰凝乳蛋白酶（以BTEE为底物）最适pH雌性为8.5, 雄性为8.0。统计结果显示, pH对红褐斑腿蝗中肠蛋白酶活性影响显著（P<0.01）, 两性间蛋白酶活性差异显著（P<0.01）。在最适pH情况下, 雌性的类胰蛋白酶活性高于雄性, 而类胰凝乳蛋白酶活性则是雄性高于雌性。在中肠pH范围内雌性比雄性具有更高的消化蛋白酶活性, 显示雌性具有较强的食物处理能力以摄取更多的营养物质为繁殖活动（孕卵）作准备, 而该种蝗虫最适pH范围较宽, 可能与其取食植物范围较宽有关。     

大豆胰蛋白酶抑制剂对棉铃虫幼虫消化生理和生长发育的影响

本研究根据棉铃虫Helicotverpa ormigera(Hubner)幼虫中肠蛋白酶在离体条件下对蛋白酶抑制剂的反应,选择具有较强抑制作用的大豆胰蛋白酶抑制剂,以0.21-4.2%(干重)的浓度配入幼虫人工饲料,测定了幼虫短期和长期取食这些饲料引起的中肠类胰蛋白酶、类胰凝乳蛋白酶和总蛋白酶活力的变化和生长抑制效应。短期取食抑制剂的幼虫,中肠弱碱性类胰蛋白酶活力显著增高,在4.2%。浓度下比对照高出21%;强碱性类胰蛋白酶、类胰凝乳蛋白酶和总蛋白酶活力显著降低,生长发育受到明显抑制。长期取食低浓度(0.84%)抑制剂的幼虫,弱碱性类胰蛋白酶和类胰凝乳蛋白酶活力显著增高,强碱性类胰蛋白酶活力显著降低。总蛋白酶活力变化不显著;长期取食高浓度(4.2%)抑制剂的幼虫,强碱性类胰蛋白酶和总蛋白酶活力显著降低,其它酶活力变化不显著。抑制剂随浓度的增高对幼虫生长的抑制作用加强,但浓度高于0.84%后,抑制强度的变化减小。据此作者认为,蛋白酶抑制剂对昆虫抗营养效应在于它对蛋白酶的激活和抑制作用,从而导致各种蛋白酶间的协调性破坏,昆虫消化过程受阻,影响生长发育。     

转Bt基因抗虫玉米对亚洲玉米螟幼虫几种主要酶系活性的影响

研究了表达Cry1Ab杀虫蛋白的转Bt基因抗虫玉米对亚洲玉米螟Ostrinia furnacalis (uenée) 幼虫解毒酶、保护酶和中肠蛋白酶活性的影响,测定比较了取食转Bt基因玉米后幼虫体内α-乙酸萘酯酶、乙酰胆碱酯酶、谷胱甘肽S-转移酶、过氧化氢酶、超氧化物歧化酶、中肠总蛋白酶、类胰蛋白酶和类胰凝乳蛋白酶的活力。结果表明,取食转Bt基因玉米48 h后亚洲玉米螟幼虫体内的α-乙酸萘酯酶、谷胱甘肽S转移酶活力明显低于对照;而乙酰胆碱酯酶活力显著高于对照,在取食48 h、60 h和72 h的活力分别是对照的2.00、1.50和2.50倍。保护酶系、中肠总蛋白酶、弱碱性类胰蛋白酶和类胰凝乳蛋白酶的活性在取食48 h后明显受到抑制;但强碱性类胰蛋白酶的活性显著高于对照,取食48 h、60 h和72 h的活力分别是对照的4.00、1.67和1.33倍。乙酰胆碱酯酶和强碱性类胰蛋白酶可能与亚洲玉米螟对Bt的抗性有关。     

Cry2Ab及Cry1Ac杀虫蛋白对棉铃虫中肠蛋白酶活性的影响

为明确Cry2Ab和Cry1Ac2种Bt杀虫蛋白单用与混用对棉铃虫Helicoverpa armigera（Htibner）中肠主要蛋白酶活性的影响,本文测定了取食含不同Bt蛋白人工饲料后棉铃虫中肠总蛋白酶、类胰蛋白酶和类胰凝乳蛋白酶活性的差异。结果发现：Cry2Ab处理12h后对棉铃虫中肠总蛋白酶影响不大;对类胰蛋白酶的影响最大,除最高浓度处理外,其他浓度处理后棉铃虫类胰蛋白酶的活性明显高于对照;但对类胰凝乳蛋白酶活性的影响呈倒“V”字型,只有6．67ug／gCry2Ab处理后的棉铃虫酶活力显著高于对照,其他浓度处理与对照差异不显著或略低于对照;随着取食含Cry2Ab饲料时间的增加,棉铃虫中肠类胰蛋白酶和类胰凝乳蛋白酶的活性比对照显著增加;与对照相比,处理36h后类胰蛋白酶活性最高可增加到6．43倍。Cry1Ac处理棉铃虫12h后总蛋白酶、类胰蛋白酶和类胰凝乳蛋白酶活性都明显增加,而且与处理浓度呈正相关;但是24h后,处理后棉铃虫的总蛋白酶和类胰凝乳蛋白酶活性明显降低,只有类胰蛋白酶活性仍高于对照,但活性增长倍数低于12h时的处理。Cru2Ab和Cry1Ac2种蛋白混用处理棉铃虫后,2种酶的酶活力基本低于Cry1Ac和Cry2Ab单用的酶活力之和;只有2种蛋白浓度均为2．22ug／g混用时,处理12h后类胰蛋白酶和类胰凝乳蛋白酶的活性高于2种蛋白单用时酶活力之和,且都显著的高于对照。     

蛋白酶抑制剂对绿豆象幼虫中肠蛋白酶活性的影响

为明确蛋白酶抑制剂对绿豆象幼虫中肠蛋白酶活性的影响,采用室内人工接虫和生化测定的方法,研究了在离体条件和饲喂条件下4种蛋白酶抑制剂对绿豆象幼虫中肠蛋白酶的抑制作用,并测定了绿豆象幼虫取食不同含量的绿豆胰蛋白酶抑制剂(MBTI)的人工绿豆后,其中肠内总蛋白酶、类胰蛋白酶和类胰凝乳蛋白酶活性的变化.结果表明:在离体条件下,供试4种蛋白酶抑制剂对绿豆象幼虫总蛋白酶、类胰蛋白酶和类胰凝乳蛋白酶活性均有明显的抑制作用,且浓度越大,抑制效果越显著,其中以20μg·mL^-1的MBTI对3种酶活性的抑制效果最强,3种酶活性分别比对照降低了62.5%、41.2%和38.7%,而卵粘蛋白抑制剂(OI)抑制效果最弱.绿豆象幼虫取食含不同抑制剂的人工绿豆后,中肠内3种酶活性也均受到一定的抑制作用,取食后随龄期的延长,3种酶活性有所升高但仍显著低于对照,且以MBTI的抑制作用最强.当绿豆象幼虫取食不同含量MBTI的人工绿豆后,随MBTI含量的增加,对总蛋白酶活性和类胰蛋白酶活性的抑制作用均逐渐增强,但对类胰凝乳蛋白酶活性的抑制作用并不显著,只有当MBTI含量达20%时,对类胰凝乳蛋白酶活性才表现出明显的抑制作用.     

Biochemical characterization of midgut digestive proteases from Mamestra brassicae (cabbage moth; Lepidoptera: Noctuidae) and effect of soybean Kunitz inhibitor (SKTI) in feeding assays

Proteolytic activities in soluble protein extracts from Mamestra brassicae (cabbage moth) larval midgut were analysed using specific peptide substrates and proteinase inhibitors. Serine proteinases were the major activities detected, with chymotrypsin-like and trypsin-like activities being responsible for approximately 62% and 19% of the total proteolytic activity towards a non-specific protein substrate. Only small amounts of elastase-like activities could be detected. The serine proteinases were active across the pH range 7-12.5, with both trypsin-like and chymotrypsin-like activities maximal at pH 11.5. The digestive proteinases were stable to the alkaline environment of the lepidopteran gut over the timescale of passage of food through the gut, with 50% of trypsin and 40% of chymotrypsin activity remaining after 6h at pH 12, 37 degrees C. Soybean Kunitz trypsin inhibitor (SKTI) ingestion by the larvae had a growth-inhibitory effect, and induced inhibitor-insensitive trypsin-like activity. Qualitative and quantitative changes in proteinase activity bands after gel electrophoresis of gut extracts were evident in SKTI-fed larvae when compared with controls, with increases in levels of most bands, appearance of new bands, and a decrease in the major proteinase band present in extracts from control insects.     

Identification and characterization of midgut proteases in <Emphasis Type="Italic">Achaea janata</Emphasis> and their implications

Insect midgut proteases are excellent targets for insecticidal agents such as Bacillus thuringiensis Cry toxins and protease inhibitors. The midgut proteases of Achaea janata have been characterized and Casein zymograms indicated at least five distinct activities corresponding to approx 17, 20, 29 and 80, and 90 kDa. Using a combination of synthetic substrates and specific inhibitors in casein zymograms, photometric assays and activity blots, three trypsin-like and one elastase-like serine proteases were identified but no chymotrypsin-like activity. Various proteinase inhibitors displayed differential inhibitory effects towards the midgut proteases.     

12a-羟基鱼藤酮对斜纹夜蛾生殖力的影响及其作用机理

为探讨12a-羟基鱼藤酮对斜纹夜蛾Prodenia litura (Fabricius)生殖力的影响及其作用机理, 本文测定了该虫取食12a-羟基鱼藤酮后的产卵量。在用高效液相色谱仪确定其卵巢组织中存在12a-羟基鱼藤酮后, 通过MTT法测定该化合物对斜纹夜蛾卵巢细胞（PL细胞）的细胞毒性,并利用流式细胞仪检测该化合物对PL细胞细胞周期、膜电位、胞内钙离子浓度、线粒体膜电位的影响。结果表明:斜纹夜蛾幼虫取食12a-羟基鱼藤酮后产卵量下降80％以上, 并从卵巢组织中检测出该化合物。12a-羟基鱼藤酮对PL细胞增殖具有抑制活性, 其IC₅₀为6.6 mg/L。该化合物将PL细胞周期阻滞于S期, 导致PL细胞膜电位、线粒体膜电位和细胞内游离钙离子浓度均显著升高。该化合物导致斜纹夜蛾繁殖力降低。12a-羟基鱼藤酮将PL细胞增殖阻滞于细胞周期的S期。同时, 该化合物对卵巢细胞具有较弱的毒杀活性, 导致一些卵巢细胞死亡。由于上述原因, 卵巢细胞数量逐渐减少而导致卵巢管萎缩。卵巢管的萎缩使卵巢管内的卵母细胞不能发育成卵细胞, 故其生殖力下降。