重组泛素连接酶tTRIP-U-box的构建与表达

目的：构建重组泛素连接酶tTRIP-U-box,并克隆进入pFLAG—CMV4真核表达载体,为研究通过靶向降解接头蛋白TRAF（TNFReceptorAssociatedFactor）家族蛋白,从而抑制破骨细胞活性提供基础。方法：分别设计引物,扩增tTRIP（TRAF-interactingprotein）分子C端伸展的coiled．coiled结构域以及E3泛素连接酶CHIP的U—box结构域,再利用重组PCR,将tTRlP与U-box进行融合,双酶切之后将其插入真核表达载体pFLAG．CMV4,经过酶切鉴定及测序后,转染HEK-293T细胞系,Western印迹验证重组质粒的表达。结果：PCR结果显示tTRIP截短分子和tTRIP—U-box条带大小分别为660bp和1188bp,重组质粒经酶切鉴定和测序证实正确,转染后可见融合蛋白的表达。结论：成功构建真核重组表达载体pFLAG-CMV4一tTRIP-U—box,并且转染HEK-293T细胞系后证实其能够正确表达。     

重组泛素连接酶PTB-U-box/RING的构建与表达

目的 构建重组泛素连接酶PTB-U-box、PTB-RING,并克隆进入pFLAG-CMV4真核表达载体,为研究靶向降解受体型酪氨酸激酶IGF-IR,抑制肿瘤细胞生长提供基础.方法 分别设计引物,扩增接头分子IRS-1的PTB结构域以及E3泛素连接酶CHIP的U-box、Cbl的RING结构域,再利用重组PCR,将PTB分别与U-box、RING进行融合,双酶切之后将其插入真核表达载体pFLAG-CMV4,经过酶切鉴定及测序后,转染HeLa细胞,Western 印迹验证重组质粒的表达.结果 PCR结果显示PTB-U-box条带大小840 bp,PTB-RING大小为620 bp,重组质粒经酶切鉴定和测序结果正确,转染后可见融合蛋白的表达.结论 成功构建真核重组表达载体pFLAG-CMV4-PTB-U-box和 pFLAG-CMV4-PTB-RING,并且转染HeLa细胞后证实其能够正确表达.     

USP22基因克隆及其融合蛋白真核表达载体的构建

目的克隆人类泛素水解酶22（ubiquitin—specific processing enzyme22,USP22）基因,构建与绿色荧光蛋白融合表达的真核载体。方法利用RT—PCR技术以HeLa细胞总RNA为模板分别扩增USP22基因cDNA序列两片段,依次插入真核表达载体pEGFP—N1;重组质粒转染HEK293T细胞,观察融合蛋白表达及绿色荧光的分布。结果测序结果显示USP22序列与GenBank收录数据一致,酶切显示重组质粒pEG—FP—USP22构建无误,质粒转染后有80％左右HEK293T细胞表达绿色荧光,且在胞质与胞核中广泛分布。结论成功克隆USP22基因并构建与GFP融合表达的真核载体,为进一步深入研究USP22基因的生物学功能奠定了基础。     

TRIM25及其缺失突变体真核表达载体的构建及表达

目的:扩增先天性免疫中具有重要功能的泛素连接酶TRIM25及其不同结构域的cDNA,构建带有不同标签的融合蛋白载体并进行细胞表达。方法:以TRIM25 cDNA为模板,PCR扩增不同结构域cDNA,扩增产物及载体经酶切、连接后,转化大肠杆菌DH5α,挑克隆,提取重组质粒后酶切鉴定、测序,将测序正确的重组质粒转染293细胞,用Western印迹对融合蛋白的表达进行鉴定。结果:TRIM25、Two-BOX结构域、SPRY结构域以正确读框插入Flag-pcDNA3.0,TRIM25以正确读框插入pCMV-Myc,RING结构域、CDD结构域、Two-BOX结构域以正确读框插入pEGFP-c1,上述重组质粒能够在293细胞中表达。结论:构建了TRIM25及其突变体的重组表达质粒并获得表达,为研究不同RNA病毒通过与TRIM25作用抑制宿主功能提供了基础。     

瞬时外向钾通道Kv4.3真核表达载体的构建

[目的]构建Kv4.3真核表达载体,观察其在真核细胞中表达情况。[方法]提取小鼠前额叶皮质RNA,通过RT-PCR和常规PCR技术扩增获得Kv4.3目的基因,利用EcoRⅠ和XbaⅠ限制性内切酶和T4 DNA连接酶将其克隆在pcDNA3.1载体中,并将构建好的重组质粒转染至HEK293细胞中,免疫印迹方法检测Kv4.3蛋白表达。[结果]成功扩增了Kv4.3基因(2 000 bp处有明显条带),先后经酶切和酶连后的重组体转化培养,提取质粒,再通过双酶切观察到2 000 bp处有Kv4.3目的条带和5 400 bp处有pcDNA3.1载体条带。将此重组质粒送去测序,结果显示基因测序结果与GenBank中Kv4.3序列一致。免疫印迹结果发现在HEK293细胞中,转染的重组质粒能够表达Kv4.3蛋白。[结论]成功构建了Kv4.3真核表达载体,其在HEK293细胞中可以稳定表达。     

应用LC3B-PLA2研究Atg4B对LC3B的切割作用

目的:构建带Myc标签的LC3B-PLA2基因的真核表达质粒,获得LC3B-PLA2融合蛋白,并应用LC3B-PLA2研究Atg4B对LC3B的切割作用。方法:以本实验室保存的乳腺文库为模板,PCR扩增获得LC3B序列,与PLA2G10拼接后插入pCMV-Myc载体,用构建的重组质粒转染HEK293T细胞,Western印迹检测融合蛋白的表达,用LC3B-PLA2与Atg4B共转染的方法检测Atg4B对LC3B的切割作用。结果:菌液PCR、重组质粒双酶切及测序均表明重组质粒构建成功,Western印迹结果表明融合蛋白在HEK293T细胞中获得表达,LC3B-PLA2真核表达蛋白能够应用于Atg4B对LC3B切割作用的研究。结论:构建了pCMV-Myc-LC3B-PLA2真核表达质粒,LC3B-PLA2融合蛋白在Atg4B对LC3B切割作用的研究中至关重要,为进一步研究Atg4B在自噬过程中的作用奠定了基础。     

SCG10基因重组质粒的构建及蛋白表达和定位

目的构建SCG10真核表达载体并证实融合蛋白在细胞内表达及定位。方法以人胎脑cDNA文库为模板,PCR扩增SCG10全长编码基因,亚克隆至pEGFP-C1表达载体中。将构建的重组质粒测序并转染到人胚肾HEK293中,提取细胞蛋白进行Western blot检测。利用共聚焦激光扫描显微镜观察pEGFP-SCG10在HEK293细胞内定位。结果 SCG10全长基因序列克隆到了真核表达载体pEGFP-C1中,酶切鉴定片段大小540bp。Western blot检测到了融合蛋白表达,分子量约为48kD。pEGFP-SCG10在细胞内定位以细胞浆为主,在细胞核少量表达。结论成功构建了SCG10全长基因真核表达载体,pEGFP-SCG10蛋白主要定位于HEK293细胞浆内。     

用Gateway 系统构建携带Grb2-SH2 基因重组慢病毒载体

目的:构建携带Grb2-SH2基因重组慢病毒载体。方法:把Grb2-SH2基因从合成的工程载体PUC-57中导到入门载体pentr-3C中,再利用LR反应重组到目的载体plenti,通过酶切和测序分析对比验证Grb2-SH2基因后,将plenti-Grb2-SH2质粒利用慢病毒转染系统转染人胚胎肾上皮细胞株293T细胞获得携带Grb2-SH2慢病毒载体。结果:构建的重组质粒经酶切及测序和分析比对鉴定正确,目的基因片段大小约为500bp;该质粒与包装质粒共转染293T细胞获取的慢病毒,转染效率约为90%。结论:成功构建转载质粒plenti-Grb2-SH2及携带Grb2-SH2基因慢病毒载体。     

HAX1和EGFP共表达重组腺病毒载体的构建、鉴定

目的构建和鉴定HAX1和EGFP双基因共表达重组腺病毒载体。方法采用DNA重组技术,将目的基因HAX1克隆至含有报告基因EGFP的穿梭质粒pAdTrack—CMV中,并转化于大肠埃希菌DH5a;筛选出重组质粒pAdTrack—CMV—HAX1,并在BJ5183细菌中与pAdEasy-1质粒进行同源重组,产生重组腺病毒载体;用lipofectamine将其转染HEK293细胞,包装携带全长HAX1的重组复制缺陷型腺病毒pad—HAX1-EGFP,酶切和序列测定鉴定;用制备好的Ad—HAX1-EGFP感染HEK293细胞,流式细胞术检测其感染效率,RT—PCR、Western印迹鉴定外源基因HAX1的表达。BrdU检测感染了Ad—HAX1-EGFP的HEK293细胞增殖情况。结果pAdTrack—CMV—HAX1重组质粒构建成功。pAdTrack—CMV—HAX1质粒与pAdEasy-1质粒同源重组后与预期结果相符。构建好的Ad—HAX1-EGFP能有效感染HEK293细胞;外源基因能在239细胞中有效表达。HAX1高表达的HEK293细胞其增殖率得以提高。结论成功构建了表达HAX1和EGFP共表达的重组腺病毒载体,HAX1能够促进结肠癌细胞HEK293细胞的增殖。     

应用Ad Easy载体系统构建人β2-AR基因重组腺病毒

目的:利用Ad easy腺病毒表达系统构建含人β2-肾上腺素能受体(β2-AR)基因重组腺病毒,并在HEK293细胞中扩增制备重组腺病毒.方法:将β2-AR全长cDNA插入到腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV,构建pAdTrackCMV-β2AR重组质粒,经PmeI酶切线性化后经电击法转入含Ad easy质粒的电感受态菌BJ5183进行重组.挑选同源重组质粒,Pac I酶切线性化转染HEK293细胞包装成重组腺病毒颗粒.将重组病毒和SD大鼠心肌细胞共培养,western-blot检测β2-AR的表达.结果:琼脂糖凝胶电泳显示在1242bp处有特异性条带后被克隆至腺病毒穿梭质粒.重组穿梭载体经Hind Ⅲ和Xba Ⅰ限制性酶切可以得到目的条带并经测序证实.电击法转化BJ5183所得候选重组子经PacⅠ酶切后得到30Kb腺病毒基因组片段和4.5Kb氨苄抗性片段,证实获得同源重组质粒.转染293细胞可以看到绿色荧光蛋白,以MOI100转染SD大鼠心肌细胞发现携带β2-AR的腺病毒可以在心肌细胞中过表达.结论:利用新型腺病毒载体在短时间内成功构建了携带有人β2-AR基因的腺病毒,为进一步研究人β2-AR基因治疗奠定了基础.     

人Cuedc2真核表达载体的构建及其在HEK293细胞中的表达

目的:构建人Cuedc2的真核表达载体,并进行体外验证。方法:提取人卵巢癌细胞总RNA,通过RT-PCR的方法其反转录为cDNA;以之为模板,利用PCR获得Cuedc2的编码区,纯化后克隆入pcDNA3.1myc-his(-),利用菌落PCR及DNA测序进行鉴定。最后,采用瞬时转染的方法,将所构建的重组CUEDC2真核表达载体通过脂质体转染HEK293细胞,48h后通过western blot检测Cuedc2蛋白的表达。结果:Cuedc2编码区cDNA正确地插入真核表达载体pcDNA3.1myc-his(-)中,western blot检测证实其在HEK293细胞中表达,而空载体转染的细胞为阴性,表明所构建的pcDNA3.1myc-his(-)-Cuedc2能够在体外有效表达。结论:本研究成功地克隆了人Cuedc2 cDNA,构建了重组真核表达载体,并在HEK293细胞中有效表达,为进一步研究人Cuedc2的功能及其与肿瘤的关系奠定了实验基础。     

猪内源性反转录病毒囊膜基因env真核表达质粒的构建及鉴定

目的:构建猪内源性反转录病毒(PERV)囊膜基因env的真核表达质粒pHCMV-env并加以鉴定,为研究PERV的细胞嗜性和宿主范围奠定基础。方法:用RT-PCR方法扩增五指山猪来源PERV的env基因,将其插入pGEM-T easy载体中,构建重组质粒pGEM-T-env,酶切鉴定正确后,将pGEM-T-env与pHCMV-VSV-G表达质粒同时经EcoRⅠ酶切消化后连接,构建重组表达质粒pHCMV-env,并进行酶切、测序鉴定;将鉴定正确的质粒pHCMV-env转染HEK293T细胞,采用PCR、RT-PCR检测转染后env基因的整合和转录情况。结果:扩增得到五指山猪来源PERV的env基因,并构建了pHCMV-env真核表达质粒,转染HEK293T细胞系后,该细胞系中有目的基因的整合和转录。结论:构建了真核表达质粒pHCMV-env,并且在HEK293T细胞中能够整合并转录,为研究PERV的细胞嗜性和宿主范围奠定了基础。     

斑马鱼notch3基因真核表达载体的构建及其表达分析

为了进一步研究notch3基因在斑马鱼中的功能,构建了斑马鱼notch3真核表达载体并在真核细胞中成功表达.其中斑马鱼notch3基因编码序列(coding sequence,CDS)从NCBI的在线数据库中获得,根据序列克隆其胞内段(notch intracellular domain,NICD),接着利用同源重组技...     

突变型人TRBP 基因的构建及表达

目的:探讨RNAi过程中TRBP传递双链RNA的机制,构建RNA结合结构域突变的人TRBP基因真核表达载体。方法:设计突变引物,通过拼接PCR将突变型TRBP基因克隆入pFLAG-CMV4真核表达载体,经双酶切和测序鉴定正确后,命名为pFLAG-CMV4-TRBPm。瞬时转染HEK-293细胞,western-blot检测目的蛋白表达。结果:成功扩增了突变序列,构建了突变型TRBP基因的真核表达载体,转染HEK-293细胞后检测到带标签的目的蛋白表达。结论:突变型TRBP基因真核表达载体的成功构建,为进一步研究TRBP的生物学效应奠定了基础。     

人源性基因PLC-γ1中SH2-SH2-SH3 结构域的克隆、表达及纯化

利用RT-PCR技术将人源性PLC-γ1中的SH2-SH2-SH3 结构域基因扩增并克隆到载体pGEX-2T中,经热激反应转化到大肠杆菌BL21菌株内,在低温（33℃）下、利用IPTG诱导表达构建的重组基因的高效表达体系,利用谷胱甘肽琼脂糖（sepharose ）4B纯化得到高表达的重组蛋白。SDS-PAGE 和Western blot检测表明,PLC-γ1的SH2-SH2-SH3 结构域重组基因可在低温（33℃）条件下在E .coliBL21细胞中稳定完整表达,但是在较高温度下（37℃）会产生SH2-SH2-SH3 结构域不完全表达的现象。上述研究结果为人源性重组基因PLC-γ1中SH2-SH2-SH3 结构域的深入研究和广泛应用奠定了基础。     

基于λ-Red重组酶系统的Ⅳa2基因缺失及重组腺病毒的包装

本研究用λ-Red重组酶介导的PCR打靶方法缺失腺病毒基因组上Ⅳa2基因的大部分编码序列(1104 bp),并获得一种Ⅳa2基因缺失的重组腺病毒。首先构建PCR打靶的含有卡那霉素抗性表达盒的模板质粒pAK,再以pAK为模板扩增出两端含39 bp同源臂的线性DNA片段;将pFG140质粒及线性DNA片段依次转化到宿主菌BW25113/pIJ790中,通过λ-Red重组酶介导的同源重组获得了缺失Ⅳa2基因的腺病毒基因组质粒pFG140-ΔⅣa2(1104)。酶切及DNA测序结果显示,用λ-Red重组酶介导的PCR打靶方法在pFG140上精确地缺失了预计的Ⅳa2基因3’端的1104bp片段。用PCR方法扩增获得Ⅳa2基因全长ORF,插入表达载体pAAV2neo中,构建成Ⅳa2基因表达质粒pAAV2neo-Ⅳa2。将pFG140-ΔⅣa2(1104)与pAAV2neo-Ⅳa2共转染HEK293细胞,成功地获得了重组腺病毒Ad5ΔⅣa2(1104)。Western Blot的结果表明,Ad5ΔⅣa2(1104)病毒感染的HEK293细胞检测不到Ⅳa2蛋白的表达。本研究建立了一种对腺病毒基因组直接进行缺失操作的λ-Red重组酶介导的PCR打靶方法,并获得了一种IVa2基因大部分缺失的重组腺病毒。     

人ANKRD49基因真核表达载体的构建及其功能的初步研究和RNA干扰靶点的鉴定

目的: 克隆人ANKRD49基因并构建其真核表达重组体,利用构建成功的ANKRD49真核表达重组体对其进行功能的初步研究,并筛选和鉴定其RNA干扰靶点. 方法: 提取人肺腺癌细胞株A549总RNA,逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)对ANKRD49进行扩增,扩增产物与真核表达载体p3×Flag-CMV-14同时进行双酶切,酶切产物连接后转化入感受态细胞Top10,阳性重组质粒p3×Flag-CMV-14/ANKRD49经菌液PCR、双酶切和测序鉴定正确后,用脂质体法(Lipofectamine^TM 2000)转染人胚肾细胞(HEK 293T),免疫印迹(Immunoblotting)和免疫荧光技术检测表达产物.免疫荧光法检测ANKRD49在宿主细胞内的定位.MTT法检测ANKRD49对宿主细胞的增殖作用.设计并合成针对人ANKRD49基因的RNA干扰靶点序列,与p3×Flag-CMV-14/ANKRD49共转染HEK 293T细胞后,Immunoblotting鉴定ANKRD49的RNA干扰靶点. 结果: RT-PCR结果显示,从A549细胞中扩增出约720 bp的片段.菌液PCR、双酶切及测序结果显示重组质粒p3×Flag-CMV-14/ANKRD49构建成功且序列正确.免疫荧光和Immunoblotting结果显示,在转染p3×Flag-CMV-14/ANKRD49的细胞中有ANKRD49的表达,蛋白质相对分子质量(Mr)约为27kDa,而转染空质粒组未见表达.MTT结果显示,ANKRD49对细胞增殖没有影响.共转染实验结果显示,1号和4号RNA干扰序列可以有效降低人ANKRD49的表达. 结论: 成功构建了真核表达重组体p3×Flag-CMV-14/ANKRD49,该蛋白质位于细胞核,不参与细胞增殖;同时鉴定出该基因的2个有效干扰靶点,为进一步研究其功能奠定了基础.