表达中东呼吸综合征冠状病毒S蛋白的重组痘苗病毒的构建及免疫效果初步评价

目的:以痘苗病毒天坛株为载体,构建表达中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-Co V)S蛋白的重组病毒疫苗,并进行免疫效果评价。方法:通过PCR扩增获得去除跨膜区的S蛋白基因片段SQ,并构建重组痘苗病毒载体质粒p JSC11Lac Z7.5SQ,将重组质粒与痘苗病毒同源重组并单斑纯化获得重组病毒毒株RVVMERS-SQ,重组病毒免疫小鼠后用酶联免疫吸附实验(ELISA)和假病毒微量中和实验检测其诱发的S蛋白体液免疫反应水平。结果:构建了表达MERS-Co V去跨膜区S蛋白的重组病毒RVVMERS-SQ,其免疫小鼠后诱发了强的S蛋白体液免疫反应,血清Ig G抗体滴度为1∶3200,中和抗体滴度达到1∶1000。结论:重组痘苗病毒RVVMERS-SQ可在BALB/c小鼠体内诱发强的免疫反应,为MERS-Co V疫苗的研发提供了实验基础。     

单纯疱疹病毒1型囊膜糖蛋白gD在大肠杆菌中的表达、纯化及其免疫活性的鉴定

目的:在大肠杆菌中表达1型单纯疱疹病毒(HSV-1)囊膜糖蛋白gD,纯化重组蛋白并对其免疫活性进行鉴定。方法:将HSV-1 gD 基因克隆入原核表达载体pET-28b,利用异丙基-B-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导重组质粒转化的大肠杆菌,探讨IPTG浓度、诱导时间、诱导温度对重组蛋白表达的影响;盐酸胍裂解变性包涵体,镍柱亲和层析法纯化gD蛋白,并对纯化后的蛋白进行透析复性;Western blot和ELISA检测gD蛋白的免疫活性。结果:酶切和测序结果表明gD基因克隆入pET-28b载体。该重组质粒转化的大肠杆菌经IPTG诱导后重组蛋白主要以包涵体形式存在,大小约40kDa。gD蛋白诱导表达的最佳条件为0.5mmol/L IPTG于37℃诱导8h。镍柱亲和层析法纯化获得的gD蛋白总量为3.1mg/L,透析复性后获得的gD蛋白总量为1.3mg/L,复性率为41.37%。Western blot及ELISA检测表明表达的gD蛋白具有免疫活性。结论:在大肠杆菌中表达并纯化获得具有免疫活性的HSV-1 gD蛋白,为进一步制备HSV-1诊断试剂和预防疫苗奠定了基础。     

登革2型病毒43株prM基因片段在痘苗中的克隆与表达

利用RT-PCR技术获得登革2型病毒中国分离株(D_2-43)的prM基因片段。扩增产物经酚:氯仿抽提纯化之后,直接插入pT_7BlueT载体中,经DNA序列分析证明了所扩增片段序列的正确性。构建了痘苗病毒载体PJSA1175/prM,外源基因受痘苗病毒启动子P_(7.5K)的调控。脂质转染(Lipofection)法获得D_2-43株prM蛋白的重组病毒。荧光检测显示,重组痘苗病毒表达的prM蛋白分布于细胞表面。间接ELISA测定其滴度为1:4。     

人Ⅰ型免疫缺陷病毒gag-env嵌合基因在重组痘苗中的表达

Gag和Env蛋白是人Ⅰ型免疫缺陷病毒(Humanimmunodeficiencyvirustype1,HIV1)的结构蛋白,是HIV1诱导机体产生体液免疫和细胞免疫的主要抗原。本实验通过多次亚克隆,将env基因以正确的三联密码读框插入gag基因的下游,制备了HIV1gagenv嵌合基因,并将嵌合基因分别置于痘苗病毒p75启动子和牛痘病毒A型包涵体(ATI)启动子的下游,经过同源重组和红细胞吸附试验筛选,获得了2株重组痘苗病毒。免疫荧光试验和酶免疫试验证明,两株重组痘苗病毒均能正确地表达HIV1gagenv嵌合基因。动物实验表明,gagenv嵌合基因重组痘苗病毒可诱导小鼠产生抗HIV特异性抗体。这些结果为艾滋病颗粒化疫苗的研制提供了借鉴。     

汉滩病毒A9株M基因片段在重组痘苗病毒中的表达及鉴定

为发展国产化肾综合征出血热（ＨＦＲＳ）病毒基因工程疫苗,选择了汉滩病毒Ａ９株Ｍ基因片段为目的基因,构建转染质粒ｐＪＳＢＡ９Ｍ。以携带Ｌａｃ基因的重组病毒为亲本,使表达载体ｐＪＳＢ－Ａ９Ｍ上的Ｍ片段与痘苗病毒内的Ｌａｃ基因重组,将Ｌａｃ置换成Ａ９Ｍ片段。用蓝白斑法筛选重组痘苗病毒,经ＰＣＲ扩增证实Ａ９Ｍ片段重组入痘苗病毒基因组内。重组痘苗病毒感染的Ｖｅｒｏ Ｅ６细胞,用抗糖蛋白单克隆抗体（ＨＣＯ２、     

小鼠对重组痘苗病毒表达流感病毒血凝素的免疫反应

实验比较了小鼠对表达流感病毒A/NJ/11/76(H1N1)和A/Jap/305/57(H2N2)血凝素基因的痘苗病毒重组株HSW2和VInf1的免疫反应,两株重组病毒经静脉或静脉加鼻腔免疫小鼠后都产生相应血凝抑制抗体;用不同剂量的痘苗病毒重组株HSW2皮内接种家兔也产生相应抗体,且抗体滴度与接种的病毒量成正比关系,但用痘苗病毒野毒株免疫的家兔未测到抗体,这两株痘苗病毒重组株免疫的小鼠,能保护小鼠对流感病毒母株的攻击,HSW2和VInf1的保护指数分别为3.3和3.9个对数,但这两株病毒未能诱导细胞毒性T细胞反应。     

表达甲型肝炎病毒抗原的重组痘苗病毒(VMS11 HAV25)的免疫原性

甲型肝炎(甲肝)病毒基因全部开放读码框架cDNA重组于痘苗病毒天坛株DNA的HindⅢM片段,获得了重组痘苗病毒VMS11HAV25。用10~7PFU或10~8PFU病毒量皮内免疫家兔,能诱生甲肝病毒抗体,其滴度与免疫剂量、免疫次数及间隔有关。组织培养中和试验表明,该抗体具有中和甲肝病毒的能力。VMS11HAV25的免疫效果似优于本实验室已报道的另一株甲肝病毒基因重组于TK区的重组痘苗病毒Re41。     

Ⅰ型单纯疱疹病毒 gD基因片段的高效表达及抗原性分析

目的 获得高表达的Ⅰ型单纯疱疹病毒(HSV)被膜糖蛋白gD（简称gD1）基因的工程菌。方法 通过计算机分析,筛选出疱疹病毒gD1中优势抗原决定簇的基因片段。将克隆的基因片段插入表达载体pTrxA内,转化大肠杆菌Rosetta,以异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导表达。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析表达产物。　结果　PCR扩增出约930bp的gD1编码基因目的片段,与预期片段大小相符,经测序鉴定无基因突变;所构建pTrxA-gD1重组表达质粒阳性克隆经PCR与双酶切鉴定,与预期结果一致;含有pTrxA-gD1重组质粒的大肠杆菌Rosetta诱导后得到了高效达,SDS-PAGE显示表达产物约Mr48000（Dalton）。免疫印迹结果表明表达产物具有较好的抗原性。结论　成功构建了pTrxA-gD1表达质粒,实现了成熟gD1蛋白在大肠杆菌中的高效表达,表达产物具有好的抗原性。     

HIV结构蛋白与痘苗病毒共表达产物的免疫原性研究

目的 将艾滋病病毒外膜蛋白(env)与干扰素(IFNα-2b)融合基因表达的融合蛋白作为免疫原免疫小鼠,观察小鼠的免疫功能状态和细胞免疫应答.方法 将IFNα-2b基因片段插入到env基因的下游,经脂质体转染,筛选重组痘苗病毒,经SDS-PAGE和Western blot鉴定表达产物.用重组病毒vJ1 6env/IFNα-2b免疫小鼠,以生理盐水和野生型痘苗病毒作为对照,检测小鼠脾淋巴细胞对ConA、LPS及IgG的反应性;用流式细胞仪测定小鼠脾淋巴细胞CD4 、CD8T细胞计数与CTL.结果 与对照组比较,实验组脾淋巴细胞对ConA、LPS及IgG的反应性显著增高(P＜0.05);CD4T淋巴细胞计数和CTL活性也显著增高(P＜0.05);CD8T淋巴细胞计数呈增高趋势,但未达到显著意义的程度.结论 重组痘苗病毒v J16env/IFNα-2b能增强小鼠的免疫功能和诱导细胞免疫.     

非复制重组痘苗病毒表达人免疫缺陷病毒Bostwana C亚型Nef蛋白及免疫效果的观察

从含人类免疫缺陷病毒Ⅰ型(HIV-1)Bostwana C亚型全基因的质粒pJM4-HIV中克隆了nef基因,并利用非复制型痘苗病毒载体构建表达Nef蛋白的重组病毒NTVJ1175nef,经PCR和Southern blot鉴定,nef基因正确整合到痘苗病毒基因组的J片段上;感染人源细胞后,经Western blot和免疫荧光检测表明,重组病毒能很好地表达Nef蛋白,并定位于细胞质中.NTVJ1175nef免疫BALB/c小鼠后,经Pep-IFN-'γ-Assay法检测,可诱导产生针对表位肽P1特异的可分泌IFN-'γ的C 8 T细胞(占脾细胞总数0.20%);经乳酸脱氮酶(LDH)法检测证实,诱导的细胞毒性T细胞(CTL)可特异性地杀伤表位肽P1特异P815靶细胞.这些结果表明,NTVJ1175nef具有良好的细胞免疫原性,为下一步构建表达包含HIV早期抗原的多组分重组痘苗病毒候选疫苗奠定了免疫学基础.     

以痘苗病毒天坛株为载体的表达单纯疱疹病毒Ⅰ型糖蛋白D的重组活疫苗的建立

从我国分离到的一株单纯疱疹病毒Ⅰ型（ＨＳＶ－１－１６８株）病毒基因组中,分离出含有糖蛋白Ｄ（ｇＤ）基因的１．２ｋｂ片段,插入带有痘苗病毒天坛株ＴＫ区的质粒ｐＪＳＢ１１７５Ｐ７．５ｋ启动子下游,转染无白血病鸡胚原代细胞,获得带有ＨＳＶ－１－１６８ｇＤ基因的重组痘苗病毒。此株重组病毒在感染细胞膜上表达ＨＳＶ－１－１６８ｇＤ糖蛋白抗原,能与特异性单克隆抗体反应。在感染细胞中表达的膜抗原经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析,表达分子量为５４ｋＤ糖蛋白。用Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交分析了重组病毒ＤＮＡ中特异的ｇＤ基因,对作为活疫苗的重组痘苗病毒株进行了一些微生物学活性、免疫原性和毒力等方面的研究。     

Immunization with a vaccinia virus recombinant expressing herpes simplex virus type 1 glycoprotein D: long-term protection and effect of revaccination.

Previously we showed that mice immunized with a vaccinia virus vector expressing the herpes simplex virus type 1 (HSV-1) glycoprotein D (gD) gene (vaccinia/gD) were protected against both lethal and latent infections with HSV-1 for at least 6 weeks after immunization (K. J. Cremer, M. Mackett, C. Wohlenberg, A. L. Notkins, and B. Moss, Science 228:737-740, 1985). In the experiments described here, we examined long-term immunity to HSV following vaccinia/gD vaccination, the effect of revaccination with vaccinia/gD, and the impact of previous immunity to vaccinia virus on immunization with the gD recombinant. Mice immunized with vaccinia/gD showed 100, 100, and 80% protection against lethal infection with HSV-1 at 18, 44, and 60 weeks postimmunization, respectively. Protection against latent trigeminal ganglionic infection was 70, 50, and 31% at 6, 41, and 60 weeks postvaccination, respectively. To study the effect of reimmunization on antibody levels, mice vaccinated with vaccinia/gD were given a second immunization (booster dose) 3 months after the first. These mice developed a 10-fold increase in neutralizing-antibody titer (221 to 2,934) and demonstrated a significant increase in protection against lethal HSV-1 challenge compared with animals that received only one dose of vaccinia/gD. To determine whether preexisting immunity to vaccinia virus inhibited the response to vaccination with vaccinia/gD virus, mice were immunized with a recombinant vaccinia virus vector expressing antigens from either influenza A or hepatitis B virus and were then immunized (2 to 3 months later) with vaccinia/gD. These mice showed reduced titers of neutralizing antibody to HSV-1 and decreased protection against both lethal and latent infections with HSV-1 compared with animals vaccinated only with vaccinia/gD. We conclude that vaccination with vaccinia/gD produces immunity against HSV-1 that lasts over 1 year and that this immunity can be increased by a booster but that prior immunization with a vaccinia recombinant virus expressing a non-HSV gene reduces the levels of neutralizing antibody and protective immunity against HSV-1 challenge.     

Epstein-Barr病毒基因工程活疫苗人体免疫的初步研究

Epstein-Barr(EB)病毒的原发感染发生在儿童时期,在我国3～5岁儿童的感染率为70％～90％。感染后终生带毒,并经唾液不断排出病毒。我国南方是鼻咽癌高发区,其发病率和死亡率均占恶性肿瘤的第一位。早期诊断方法的改进和早期治疗,使鼻咽癌治疗后的5年生存率明显增加,但不能降低发病率。EB病毒疫苗有可能成为控制该病的有效手段之一。 Epstein等人从淋巴母细胞株(B95-8细胞)细胞表面提取EB病毒膜抗原(MA),用于免疫棉顶猴能产生中和抗体。免疫动物能抵抗EB病毒攻击后所诱发的恶性淋巴瘤。该中和抗体在体外能中和EB病毒的转化活性。EB病毒的主要膜抗原(MA)是由分子量220kD和     

柯萨奇B3病毒基因在重组痘苗病毒中的表达

将编码柯萨奇Ｂ３病毒（ＣＶＢ３）衣壳蛋白ＶＰ１和ＶＰ２的基因,分别克隆到具有７．５ｋ启动子的痘苗病毒表达载体ｐＧＪＰ５上;将ＣＶＢ３衣壳蛋白全基因克隆到具有Ｔ７启动子的痘苗表达载体ｐＴＭ１上,并筛先到相应的重组痘苗病毒ＶＶＰ１、ＶＶＰ２和ＶＶＰ／４／２／３／１。ＶＶＰ１和ＶＶＰ２稳定表达产物为ＣＶＢ３衣壳蛋白ＶＰ１和ＶＰ２,而ＶＶＰ４／２／３／１为一无分泌性的多聚蛋白,且这三种表达产物均属无分泌性     

Expression of herpes simplex virus glycoprotein D on antigen presenting cells infected with vaccinia recombinants and protective immunity

We studied the effect of the temporal regulation of herpes simplex virus (HSV) type 1 glycoprotein D (gD-1) expression in Ia⁺ epidermal cells (EC) and macrophages on virus specific immunity and protection from HSV-2 challenge. gD-1 was expressed on the surface of cells infected with a vaccinia recombinant containing gD-1 under the control of an early vaccinia virus promoter (VP176). It was not expressed in cells infected with a recombinant (VP254) in which gD-1 is controlled by a late vaccinia virus promoter. BALB/c mice immunized with both recombinants seroconverted to HSV-2 as determined by neutralization. However, HSV specific delayed type hypersensitivity (DTH) responses were significantly (p<0.025) higher in VP176 than VP254 immunized animals. Both VP176 and VP254 immunized mice were protected from severe neurological disease due to HSV-2 challenge at 14 days post immunization, but long term protection was observed only in VP176 immunized mice.     

伪狂犬病病毒鄂A株包膜糖蛋白gD基因的克隆与表达

克隆了伪狂犬病病毒鄂A株编码包膜糖蛋白gD的基因并进行了序列测定 ,与国外报道的Rice株相比 ,其核苷酸序列具有 98%的同源性 ,推导氨基酸序列同源性为 97%。将此基因克隆于具有全期启动子盒的杆状病毒转移载体pSX35A中 ,构建成重组转移质粒pSX35A gD ,与致死缺失型线性化苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒 (AcMNPV OCC- )基因组DNA一起共转染粉纹夜蛾Hi5细胞 ,经同源重组 ,获得含gD基因的重组病毒AcMNPV OCC+ gD。重组病毒经空斑纯化后感染Hi5细胞进行表达分析 ,细胞裂解物的SDS PAGE及Western Blot ting均显示分子量约 47kD的gD蛋白得到了特异性表达 ,其表达量占细胞总蛋白的 6 2 % ,表达的gD蛋白具有免疫原性。     

用重组痘苗病毒表达pGHcDNA的研究

构建了含有ｐＧＨｃＤＮＡ的重组痘苗病毒,用ＥＬＩＳＡ证明该重组病毒在被感染的ｈ１４３细胞中,可表达出猪生长激素并将之分泌到培养基中,表达量约为１．０５μｇ／１０￣６细胞（２４ｈ）。用定位免疫化学法进一步证明该病毒可感染小鼠并在小鼠体内表达ｐＧＨｃＤＮＡ。同时还构建了含双拷贝ｐＧＨｃＤＮＡ的重组痘苗病毒,并证明其ｐＧＨ表达量比单拷贝重组病毒有明显提高,约为１．５０μｇ／１０￣６细胞（２４ｈ）。