酿酒酵母海藻糖—６—磷酸合成酶基因克隆及植物表达载体的构建

从耐热性极强的酿酒酵母菌株ＡＳ２．１４１６中分离纯化出总ＲＮＡ和mRNA,以ＡＭＶ逆录酶合成cDNA,采用保守引物,从该cDNA中扩增克隆出tps1基因,对该基因的全序列分析表明,该基因含有１５０７个核苷酸,与国外报道相关基因的同源性达９９．６５。利用ＢamＨⅠSacⅠ切点将tps1基因插入植物表达载体pBin438多克隆位点上,得到tps1基因植物表达载体重组质粒。     

编码1,3-丙二醇氧化还原酶基因的克隆和表达

采用PCR法克隆了巴氏梭菌（Clostridium pasteurianum）CpN86菌株编码1,3丙二醇氧化还原酶基因（dhaT基因）;完成了dhaT基因测序、表达载体构建和在大肠杆菌中表达;分离和纯化了dhaT基因表达的重组蛋白。实验结果：（1）PCR法克隆的dhaT基因和肺炎克雷伯氏菌Klebsiella pneumoniae菌株dhaT基因的序列同源性为829%;（2）dhaT基因表达蛋白的酶活为108U/mg;（3）dhaT基因表达的蛋白分子量为43kD;（4）Western blot确定了dhaT基因表达的蛋白和 CpN86菌株天然蛋白有相同的抗原反应。     

神经营养素-3基因的人工合成及其在毕赤酵母中的分泌性表达

根据人神经营养素3（Human neurotrohin3,hNT3）的基因序列,把编码氨基酸的密码子转换成毕赤酵母（Pichia pastoris）偏爱的形式,设计了10条36～59nt的寡聚核苷酸引物,通过5次连续PCR反应,获得了人工合成的NT3 cDNA片段（简称NT3b基因）。将合成的NT3b基因克隆到pPIC9K质粒上,获得重组表达载体pPIC9KNT3b。将重组表达载体pPIC9KNT3b和pPIC9KhNT3分别电击转化宿主毕赤酵母GS115菌株,经筛选得到重组转化子。不同转化子经甲醇诱导,表达产物进行SDSPAGE检测、Western blot检测和ELISA分析,结果表明,NT3b基因和hNT3基因成功获得分泌性表达,从整体水平上,使用偏爱密码子的NT3b基因在毕赤酵母GS115菌株中的表达明显优越于hNT3基因(x2=4.334,P<0.05),表达量在诱导后72～96h最高,达到31mg/L左右。     

假单胞菌M18rsmA-突变株的构建及其对Plt和PCA合成的区别性调控作用

假单胞菌(Pseudomonas sp.)M18是促进植物生长的根际细菌,能产生吩嗪1羧酸（PCA）和藤黄绿菌素（Plt）两种不同的抗生素抑制植物病原菌,保护植物免受病害。运用PCR方法,从M18基因组中,扩增出rsmA基因部分片段,并以该片段为探针,从M18的基因组柯斯文库中筛出阳性克隆,切取带有rsmA基因及两侧序列的15kb片段,中间插入编码Kmr的DNA片段,获得rsmA-体外突变体。运用同源重组剔除技术,构建了M18菌株的rsmA突变株M18R-。突变株M18R-生物合成Plt的能力比野生型M18提高4倍,但是,PCA产量仅为野生型的20%。研究结果表明,全局性调控基因rsmA可能通过不同的机制区别性地影响Plt和PCA的生物合成。     

以绿荧光蛋白基因为报告基因的广宿主启动子探针载体的构建和应用

将以绿荧光蛋白基因(gfp)的 cDNA为模板,用人工合成引物经PCR扩增获得的09kbDNA片段克隆到表达载体pET11C上构建成gfp表达载体pHN115。从pHN115上切下的不含启动子,但保留了SD序列的gfp基因经克隆载体SK(+)和pIJ2925亚克隆后再克隆到广谱稳定性质粒pTR102上构建成广谱、稳定、可视的启动子探针载体pHN127。并用它从费氏中华根瘤菌HN01的总DNA中成功地钓出组成型和诱导型表达的启动子。     

黄瓜花叶病毒cDNA载体在烟草细胞中表达外源基因

为了探讨利用黄瓜花叶病毒(CMV)构建表达载体的可行性,分离了山东株(SD) CMV RNA 3的全长cDNA。测定其全序列后,采用定点突变的方法在衣壳蛋白(CP)基因起始密码子处改造出一个NsiⅠ位点,可将外源基因引入NsiⅠ位点和CP基因终止密码子上游附近的XhoⅠ或SalⅠ位点而置换掉CP基因。分别用绿色荧光蛋白(GFP)基因、β-葡糖醛酸酶(GUS)基因以及小鼠二氢叶酸还原酶(DHFR)基因3种报告基因置换CP基因。将Fny株CMV RNA 1、RNA 2和SDCMV嵌合RNA 3的cDNA分别插入pCass载体的35S启动子和终止子之间,将构建的置换型载体直接以质粒的方式转染烟草原生质体,表达了3种报告基因。     

人同源盒基因NKX3.1对前列腺癌细胞的诱导凋亡作用

构建人同源盒基因NKX3.1 cDNA真核表达载体,研究其在前列腺癌细胞PC-3、LNCaP 中的表达及对细胞的促凋亡作用.以人前列腺癌细胞LNCaP细胞中的总RNA为模板,RT-PCR扩增NKX3.1基因全长编码片段,将NKX3.1 cDNA重组到真核表达载体pcDNA3.1（+）中; 将pcDNA3.1-NKX3.1表达载体瞬时转染前列腺癌细胞PC-3和LNCaP 细胞,用RT-PCR和Western印迹检测NKX3.1 cDNA在转录水平和蛋白水平的表达;绘制细胞生长曲线,观察NKX3.1对前列腺癌细胞增殖的抑制作用;用DNA/ladder和流式细胞术检测NKX3.1对前列腺癌细胞凋亡的影响,进一步用RT PCR检测凋亡相关基因caspase3、caspase8、caspase9、Apaf1、survivin和Bcl2表达的变化.人同源盒基因NKX3.1 cDNA真核表达载体pcDNA3.1-NKX3.1经酶切及测序鉴定正确. pcDNA3.1-NKX3.1转染PC-3和LNCaP细胞后,经RT-PCR和Western印迹证明能有效表达NKX3.1.生长曲线显示,前列腺癌细胞转染NKX3.1 cDNA后细胞增殖受到抑制;前列腺癌细胞转染NKX3.1 cDNA 48 h后,DNA电泳呈现具有凋亡特征的DNA ladder;流式细胞术检测出现明显凋亡峰;RT-PCR检测凋亡相关基因.结果显示,caspase3、caspase8、caspase9基因表达明显增加,Bcl2基因表达明显减少.本研究成功构建了真核表达载体pcDNA3.1 NKX3.1, 转染PC3和LNCaP细胞后能有效表达,并对细胞具有诱导凋亡作用     

费氏中华根瘤菌腺嘌呤缺陷突变株的构建与筛选

构建出费氏中华根瘤菌嘌呤合成酶基因purL的基因置换载体pHN701,purL内部NotⅠXhoⅠ片段被luxAB基因取代,造成正常基因的破坏。用该载体对野生型费氏中华根瘤菌HH103进行purL的基因置换,筛选到腺嘌呤缺陷型突变株P825。波动实验和连续转接试验结果表明该突变菌株表型十分稳定。purL表达载体pBBRPG在P825中可恢复其在基本培养基上的生长情况,证明突变株确实为purL单基因破坏。盆栽结瘤实验结果表明,该突变株只能侵染大豆根系形成不固氮的根瘤。     

外加紫杉醇对悬浮培养东北红豆杉细胞的诱导效应

研究表明外加紫杉醇能够诱导悬浮培养的东北红豆杉(Taxus cuspidata)细胞总DNA发生梯带化降解。利用mRNA差异显示技术比较了紫杉醇诱导凋亡与不诱导凋亡的东北红豆杉细胞基因表达的差异,得到了8个特异表达的cDNA克隆,经Northern杂交证实其中3个在不发生凋亡的细胞中表达,5个在凋亡的细胞中表达。对这8个cDNA克隆单向序列测定后,与GenBank/EMBL/DDBJ中同源序列进行了比较,结果表明：1个cDNA片段与拟南芥中ABA应答蛋白基因的保守区有86%的同源性;2个cDNA片段与番茄内切壳聚糖酶前体基因的保守区有50%的同源性;其他5个cDNA片段无明显的同源基因,可能是新基因。     

木糖异构酶基因xylA的克隆及其表达载体的构建

木糖异构酶基因xylA是一种正向选择标记基因,在植物基因工程中使用该标记可以获得安全的转基因植物.构建了以xylA基因为选择标记的植物表达载体.从大肠杆菌Top10中扩增出xylA基因,插入到质粒pCAMBIA2301的Xho Ⅰ位点,通过酶切和PCR检测插入片段的正确性,得到载体pCAMBIA2301-xylA,将pBI121载体上的‘35S-GUS-Nos'表达框插入到pCAMBIA2301-xylA的EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ位点.得到中间载体pCAMBIA2301-xylA-GUS,用Sac Ⅰ和Sma Ⅰ切下克隆载体上的CBF1基因替代pCAMBIA2301-xylA-GUS中的GUS片段,用电转化法将获得的表达载体转化到农杆菌中,为将来获得安全的转基因抗寒植株奠定基础.