嗜热真菌Thermomyces lanuginosus A236热稳足葡萄糖淀粉酶的纯化及其特性

嗜热真菌Thermomyces lanuginosus A2a6在液体培养基中50℃下静止培养14天,粗提酶液经硫酸铵分级沉淀、DEAE-Toyopearl离子交换层析、Butyl-Toyopearl疏水层析、Sephacryl S100凝胶过滤和FPLC Mono Q离子交换层析,得到了凝胶电泳均质的葡萄糖淀粉酶。酶促反应产物经TLC分析为葡萄糖,证明纯化的酶为葡萄糖淀粉酶(EC 3．2．1.3)。SDS-PAGE测定其分子量为72,000,不具亚基,pI为4．0,富含val和Leu。酶反应最适温度和pH分别为70℃和5．0。在pH5．0条件下,酶在60℃保温lh,仍具有原酶活性。酶活性在70℃和80℃的半衰期分别为20min和6min, Ca²⁺对酶有激活作用,Fe³⁺、Al³⁺、Hg²⁺等金属离子对酶活力有一定的抑制作用。纯酶碳水化合物含量为12．4％。纯酶可水解可溶性淀粉,直链淀粉、支链淀粉．糊精、糖原、麦芽三糖和麦芽糖,其中可溶性淀粉为最适底物。     

嗜热真菌 Thermomyces lanuginosus热稳定a—淀粉酶的纯化及特性

嗜热真菌Thermomyces lanuginosus在液体培养基中于50℃静止培养14d,培养液经硫酸铵分级沉淀、DEAE-Toyopearl离子交换层析、Butyl-Toyopearl疏水层析、SephacrylS-300分子筛层析和FPLC MonoQ离子交换层析,得到了凝胶电泳均一的淀粉酶。纯酶与淀粉反应不同时间后,用碘色反应法和DNS法测定淀粉和还原糖量,结果显示淀粉量在开始时迅速下降,但还原糖的量却增加很慢;产物经TLC层析分析为麦芽糖和少量葡萄糖。由此说明它为α-淀粉酶。用SDS-PAGE和Sephacryl S-300分子筛层析测定分子量为56000,不具亚基。酶反应最适温度和pH分别为65℃和4.5～5.0。在pH4.6条件下,酶在50℃是稳定的;60℃保温1h,仍保留94％的原酶活性;酶在70℃的半衰期为10min。钙离子对酶有激活作用。酶对糖原和糊精有一定的水解能力。     

嗜热真菌 Thermomyces lanuginosus热稳定a—淀粉酶的纯化及特性

嗜热真菌Thermomyces lanuginosus在液体培养基中于50℃静止培养14d,培养液经硫酸铵分级沉淀、DEAE-Toyopearl离子交换层析、Butyl-Toyopearl疏水层析、SephacrylS-300分子筛层析和FPLC MonoQ离子交换层析,得到了凝胶电泳均一的淀粉酶。纯酶与淀粉反应不同时间后,用碘色反应法和DNS法测定淀粉和还原糖量,结果显示淀粉量在开始时迅速下降,但还原糖的量却增加很慢;产物经TLC层析分析为麦芽糖和少量葡萄糖。由此说明它为α-淀粉酶。用SDS-PAGE和Sephacryl S-300分子筛层析测定分子量为56000,不具亚基。酶反应最适温度和pH分别为65℃和4.5～5.0。在pH4.6条件下,酶在50℃是稳定的;60℃保温1h,仍保留94％的原酶活性;酶在70℃的半衰期为10min。钙离子对酶有激活作用。酶对糖原和糊精有一定的水解能力。     

嗜热真菌hermomyces lanuginosus A236热稳定葡萄糖淀粉酶的纯化…

嗜热真菌Ｔｈｅｒｍｏｍｙｅｓ ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓＡ２３６在液体培养基中５０℃下静止培养１４天,粗提酶液经硫酸铵分级沉淀、ＤＥＡＥ－Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ离子交换层析、Ｂｕｔｙｌ－Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ疏水层析,ＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ１００凝胶过滤和ＦＰＬＣＭｏｎｏＱ离子交换层析,得到了凝胶电泳均质的葡萄糖淀粉酶。酶促反应产物经ＴＬＣ分析为葡萄糖,证明纯化的酶葡萄糖淀粉酶（ＥＣ３．２．１．３）。ＳＤＳ－Ｐ     

高温放线菌V4菌株热稳定β-淀粉酶的产生及其性质的研究

高温放线菌V₄菌株(Thermoactinomyces sp.V₄)产生的β－淀粉酶最适反应温度为70℃,最适pH为6,酶的热稳定性良好,50℃(4h)不失去酶活力,55℃(2h)保持最初活力的92％,酶对可溶性淀粉的水解率达77％,纸层析结果显示水解产物主要为麦芽糖,经旋光测定,水解产物具有β－构型。巯基抑制剂对此β－淀粉酶无抑制作用。V₄菌株同时产生异淀粉酶及少量的－菌一淀粉酶。     

嗜热真菌Thermomyces lanuginosus热稳定α—淀粉酶的纯化及特性

嗜热真菌Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ在液体培养基中于５０℃静止培养１４ｄ,培养液经硫酸铵分级沉淀、ＤＥＡＥ－Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ离子交换层析、Ｂｕｔｙｌ－Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ疏水层析、ＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ－３００分子筛层析和ＦＰＬＣ ＭｏｎｏＱ离子交换层析,得到了凝胶电泳均一的淀粉酶。纯酶与淀粉反应不同时间后,用碘色反应法和ＤＮＳ法测定淀粉和还原糖量,结果显示淀粉量在开始时迅速下降,     

一种α-环糊精葡萄糖基转移酶的纯化及性质研究

本文报道了一种主要转化产物是α-环糊精的环糊精葡萄糖基转移酶的纯化、酶学性质和转化特性。将发酵上清液通过硫酸铵分级沉淀、疏水柱层析和离子交换层析获得表观电泳纯的酶蛋白。纯酶的分子量约为75KDa,等电点5.3。最适反应温度为50℃,最适反应pH为6。对可溶性淀粉的Km值和Vmax分别是50mg/ml和6.07 mg/ml/min。色氨酸残基为酶活力的必需基团。酶的N末端序列为-SPDTSVDNKV-。Ca2+、Zn2+、Fe3+、Cu2+、Fe2+、Ag+对酶活力有强烈抑制作用。纯酶催化转化条件试验表明,廉价的马铃薯淀粉是酶催化制备α-CD的适宜底物,最佳转化条件为：酶量200u/g淀粉,温度40℃,反应时间24h,总转化率达41%,其中α-环糊精占总转化产物的78%。因此,该酶不仅表现出特殊的酶学特性,而且有较好的产业化开发前景。     

黑曲霉Tx-78耐酸性α-淀粉酶的分离纯化及其性质研究

从酒由中选育得到产耐酸性α-淀粉酶的嗜酸性黑曲霉菌株Tx-78,经酒精沉淀,CM52和DE52纤维素离子交换层析对该酶进行纯化,通过SDS-PAGE检验其纯度并测得其分子量为74 ku.该耐酸性α-淀粉酶具有显著的热稳定性及酸稳定性.其最适反应温度与pH分别为70℃和pH 4.0.当反应温度低于60℃时,该酶在pH 4.0条件下可保持稳定活性达3 h以上.Ca2 、Ba2 对提高酶活力具有明显作用.薄层层析表明该酶制剂水解淀粉最终产物主要为麦芽糖和葡萄糖.     

高温放线菌莱斯氏属RHA1菌株产低分子量α-淀粉酶的初步研究

嗜热放线菌莱斯氏属RHA1菌株发酵液经过(NH4)2SO4(饱和度为60％)沉淀后,经过分子筛层析纯化获得一种低分子量α-淀粉酶,分子量为11.2 kD.对此酶研究表明,其pH值范围为4.5 -11.5,在pH值为5.5 -6.5之间酶活性较高,最大酶活性的pH值为6.0;此酶在缺乏Ca2+时,最适温度为55 - 60℃,当加入Ca2+后,相对最适温度上升至65℃;然而EDTA(10 mmol/L)可使此酶的酶活性降低98％,同样在Ni2+、Ag2+和Fe2+条件下酶活性也受到干扰;此α-淀粉酶具有淀粉内切酶活性,水解直链淀粉和支链淀粉的主要产物为小分子低聚糖(D2 - D3).     

重组大肠杆菌热稳定性过氧化氢酶的纯化及性质研究

将产热稳定性过氧化氢酶的重组大肠杆菌培养后菌体破碎得到的粗酶液经热处理、硫酸铵分级沉淀、DEAE\|Sephadex A\|50离子交换层析、HiPrep16/10 Phenyl疏水作用层析、Superdex200 HR 10/30凝胶层析提纯后得到电泳纯的酶,比酶活达到15629U/mg。此酶的最适温度为70℃,最适pH70,在60℃保温60min酶活力基本不变,在pH3～8的范围内比较稳定。此酶的Km和Vmax分别为775mmol/L和278mmol\5min\+\{-1\}·mg-1。1mmol/L的Zn2+、Ba2+、Mn2+可使该酶完全失活,KCN、NaN\-3、Na\-2S\-2O\-4、巯基乙醇对酶活力有抑制作用,50mmol/L的EDTA不影响酶活性。     

Purification and characterization of a thermostable glucoamylase from Chaetomium thermophilum

Thermostable amylolytic enzymes are currently being investigated to improve industrial processes of starch degradation. A thermostable extracellular glucoamylase (exo-1, 4-alpha-D-glucanohydrolase, E.C.3.2.1.3) from the culture supernatant of a thermophilic fungus Chaetomium thermophilum was purified to sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) homogeneity by using ammonium sulfate fraction, DEAE-Sepharose Fast Flow chromatography, and Phenyl-Sepharose Fast Flow chromatography. SDS-PAGE of the purified enzyme showed a single protein band of molecular weight 64 kDa. The glucoamylase exhibited optimum catalytic activity at pH 4.0 and 65 degrees C. It was thermostable at 50 degrees C and 60 degrees C, and retained 50% activity after 60 min at 65 degrees C. The half-life of the enzyme at 70 degrees C was 20 min. N-terminal amino acid sequencing (15 residues) was AVDSYIERETPIAWN. Different metal ions showed different effects on the glucoamylase activity. Ca2+, Mg2+, Na+, and K+ enhanced the enzyme activity, whereas Fe2+, Ag+, and Hg2+ cause obvious inhibition. These properties make it applicable to other biotechnological purposes.     

疏绵状嗜热丝孢菌热稳定几丁质酶的纯化及其性质研究

采用硫酸铵沉淀、DEAE SepharoseFastFlow阴离子层析、Phenyl Sepharose疏水层析等步骤获得了凝胶电泳均一的疏绵状嗜热丝孢菌 (Thermomyceslanuginosus)几丁质酶。经SDS PAGE和凝胶过滤层析测得纯酶蛋白的分子量在 4 8～ 4 9 .8kD之间。该酶反应的最适温度和最适pH分别为 5 5℃和 4 5 ,在pH4 5条件下 ,该酶在 5 0℃以下稳定 ;6 5℃的半衰期为 2 5min ;70℃保温 2 0min后 ,仍保留 2 4 %的酶活性。其N 端氨基酸序列为AQGYLSVQYFVNWAI。金属离子对几丁质酶的活性影响较大 ,Ca2 、Na 、K 、Ba2 对酶有激活作用 ;Ag 、Fe2 、Cu2 、Hg2 对酶有显著的抑制作用 ;以胶体几丁质为底物的Km 和Vmax值分别为 9 .5 6mg mL和 2 2 . 12 μmol min。抗菌活性显示 ,该酶对供试病原菌有不同程度的抑制作用。     

Highly thermostable xylanase purified from Rhizomucor miehei NRL 3169

A thermostable xylanase was purified and characterized from the thermophilic fungus Rhizomucor miehei (Cooney & Emerson) Schipper. The enzyme was purified to homogeneity by ammonium sulfate precipitation, sephadex G-100 gel filtration and diethylaminoethyl cellulose anion exchange chromatography with a 29.1-fold. The enzyme was highly active within a range of pH from 5.0 to 6.5. The optimum temperature of the purified enzyme was 75°C. The enzyme showed high thermal stability at 70°C and 75°C and the half-life of the xylanase at 90°C was 30 min. Km and Vmax values at 50°C of the purified enzyme were 0.055 mg/ml and 113.5 μmol min?1 mg?1 respectively. The enzyme was activated by Ca2+, Cu2+, K+ and Na+. On the other hand, Ag2+, Hg2+, Ba2+, and Zn2+ inhibited the enzyme. The molecular weight of the xylanase was estimated to be 27 kDa by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis. The present study is among the first works to examine and describe a secreted highly thermostable endoxylanase from the Rhizomucor miehei fungus. This enzyme displays a number of biochemical properties that make it a potentially strong candidate for industrial and commercial application in pulp bleaching.     

绿色糖单孢菌木聚糖酶的分离纯化与酶学性质研究

木聚糖酶是一种重要的具有工业应用前景的木聚糖降解酶,在充分利用自然资源、保护生态环境等方面具有十分重要的意义.通过硫酸铵分级沉淀及Sephadex G-100凝胶柱层析方法从一株中度耐热耐碱放线菌—绿色糖单孢菌的胞外酶中纯化得到单一的木聚糖酶,相对分子质量为51 kD,酶纯度提高了13.01倍.纯酶最适反应温度为60℃,最适反应pH值为7.0;75℃以下该酶具有良好的热稳定性,在pH 7～10范围内具有较强的耐受力.金属离子Ca2+、Fe2+、Zn2+对该酶具有明显促进作用,Cu2+、Mn2+、Al3+和SDS具有抑制作用而K+,Na+,Mg2+没有明显的作用.该酶为大分子质量的糖基化蛋白,含糖量为21.96%.     

根霉α-半乳糖苷酶的三相分离及其酶学性质

根霉Rhizopus sp. A01发酵豆渣产α-半乳糖苷酶,粗酶液依次经过三相分离、Sephadex G-100凝胶过滤获得了电泳纯的α-半乳糖苷酶,纯化了6.7倍,总酶活回收率达到46%;凝胶过滤和SDS-PAGE显示该酶为相对分子质量为87.6kDa的单体蛋白。该酶水解对硝基苯-α-D-吡喃半乳糖苷的最适pH值为5.0,最适温度为55℃,表观Km、kcat/Km分别为2.56mmol/L、47,400L/mol·s;能微弱水解蜜二糖和棉子糖,水解蜜二糖的速率是水解棉子糖速率的3.4倍;水解活性受多种     

一株嗜热毛壳菌β-葡萄糖苷酶的分离纯化及特性

研究了液体发酵嗜热毛壳菌Chaetomium thermophile产生的β-葡萄糖苷酶的分离纯化及特性。粗酶液经硫酸铵沉淀、DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子层析、Phenyl-Sepharose 疏水层析、Sephacryl S-100分子筛层析等步骤后获得凝胶电泳均一的β-葡萄糖苷酶。经12.5%SDS-PAGE和凝胶过滤层析方法分别测得该酶的分子量大小约为78.4kDa和81kDa。该酶反应的最适温度和pH值分别为60℃和4.5-5.0。有较好的酸稳定性和热稳定性。金属离子对β-葡萄糖苷酶的活性影响较大, 其中Ca2+对酶有激活作用, 而Ag+、Cu2+ 、Hg2+对酶有显著的抑制作用。该酶对水杨苷具有很强的底物特异性。     

棒曲霉Asp-195v产蛋白酶的酶学性质研究

对液体发酵的棒曲霉Asp-195v菌株所产蛋白酶的活力进行了研究,并通过分离纯化获得了电泳纯的酶蛋白。研究结果表明,该蛋白酶的最适反应温度为40℃,在30-50℃温度范围内相对活力可保持在70%以上;最适pH为7,pH稳定范围在4-8;Mn2+对该蛋白酶活力有明显的激活作用,K+、Ag+、Cu2+、Fe2+、Mg2+、Zn2+、Ca2+、Al3+和Fe3+离子则有明显的抑制作用,尤其是Hg2+和Pb2+对酶活的抑制作用更加强烈;其他试剂如葡萄糖、EDTA对酶活的抑制作用不明显,而蔗糖、SDS和Tween-20对酶活的抑制明显;以酪氨酸为底物采用双倒数作图法测得Vmax为30.40mmol/min,Km为97.53mmol/L。该酶的表观分子量为30.1kDa。     

嗜热糖化酶基因在重组黑曲霉工程菌中的表达及酶学性质初步研究

为了提高糖化酶的耐热性能,降低淀粉糖化发酵工艺的生产成本,构建了同源整合载体pEasy-glaAdir以及pEasyssg,将黑曲霉(Aspergillus niger)的糖化酶基因(glaA)灭活,并将硫磺矿硫化叶菌(Sulfolobus solfataricus)的嗜热糖化酶基因(ssg)插入到黑曲霉基因组中,筛选得到表达嗜热糖化酶的重组黑曲霉工程菌(A.nigerWW1)。重组菌的发酵结果显示,嗜热糖化酶在黑曲霉中得到了分泌表达,发酵液酶活达到3 030 U/mL。重组嗜热糖化酶的最适反应温度为90℃,最适pH为6.0,该酶具有较高的热稳定性,在80℃时的半衰期在60 min以上,具有良好的工业应用前景。     

黑曲霉(Aspergillus niger)β-D-葡萄糖苷酶的纯化及其性质

利用垂直板凝胶制备电泳从黑曲霉(Aspergillus niger,AS 3.316)中分离提纯了β-D-葡萄糖苷酶(EC3.2.1.21),经凝胶电泳鉴定为单一带。酶作用的最适pH为4.4,在pH4.0—6.2稳定;最适温度65℃,热稳定性较好,于60℃保温4小时,活力保留80％。此酶作用于纤维二糖的Km值为6.09mM。聚丙烯酰胺薄层等电聚焦测得其pI值为5.5;用SDS凝胶电泳测得其分子量为77000。此酶不仅能水解纤维二糖和对硝基苯-β-D-葡萄糖苷,还能微弱地水解对硝基苯β-D-半乳糖苷和β-D-木糖苷。金属离子Fe~(2+)、Hg~(2+)、Cu~(2+)、Al~(3+)、Hg~+和Ag~+等对此酶有不同程度的抑制作用,蛋白质侧链修饰剂N-溴代琥珀酰亚胺对此酶有较强的抑制作用,2-羟基-5-硝基溴苯对酶也有一定的抑制作用,推测色氨酸残基对β-D-葡萄糖苷酶的活力是非常必要的。