极端耐热纤维素酶Cel74的表达、纯化与特性

从海栖热袍菌中克隆出编码热稳定性的纤维素酶基因,以热激载体pHsh为表达质粒,构建重组质粒phsh—Ceff4,并转化至大肠杆菌中进行表达。基因表达产物通过热处理和离子交换层析,重组酶纯度达电泳纯。对纯化的重组酶酶学性质研究表明,最适反应温度85℃,最适反应pH4．6,pH4．5—6．0之间酶的相对酶活在80％以上。Co^2＋对酶活性有促进作用,Ca^2＋、Mg^2＋、Zn^2＋不影响酶活性,而Cu^2＋、Ni^2＋、Mn^2＋对酶活性有抑制作用。     

重组大肠杆菌热稳定性过氧化氢酶的纯化及性质研究

将产热稳定性过氧化氢酶的重组大肠杆菌培养后菌体破碎得到的粗酶液经热处理、硫酸铵分级沉淀、DEAE\|Sephadex A\|50离子交换层析、HiPrep16/10 Phenyl疏水作用层析、Superdex200 HR 10/30凝胶层析提纯后得到电泳纯的酶,比酶活达到15629U/mg。此酶的最适温度为70℃,最适pH70,在60℃保温60min酶活力基本不变,在pH3～8的范围内比较稳定。此酶的Km和Vmax分别为775mmol/L和278mmol\5min\+\{-1\}·mg-1。1mmol/L的Zn2+、Ba2+、Mn2+可使该酶完全失活,KCN、NaN\-3、Na\-2S\-2O\-4、巯基乙醇对酶活力有抑制作用,50mmol/L的EDTA不影响酶活性。     

木聚糖酶

木聚糖酶（EC3.2.1.8)是降解木聚糖最关键的水解酶。木聚糖酶由功能或非功能结构或和连接区组成。木聚糖酶通过酸碱和亲核催化来水解β-1,4,糖苷键。由于木糖酶的工业价值,人们人不同生物筛选了大量木聚糖酶基因。     

极耐热性乳酸脱氢酶高效表达、纯化及酶学性质

从海栖热袍菌扩增出编码乳酸脱氢酶的基因并将其插入热激载体pHsh构建表达质粒,在大肠杆菌Escherichia coli中进行表达产生极耐热性乳酸脱氢酶Tm-LDH。基因表达产物通过热处理,可以一步获得接近电泳纯的重组酶。酶学性质研究表明,Tm-LDH的最适反应温度为95℃,最适pH 7.0;纯酶在90℃的半衰期为2 h,在pH 5.5–8.0之间最稳定;SDS-PAGE结果显示分子量为33 kDa,与理论推算值相吻合。以丙酮酸和NADH为底物时,相对于丙酮酸的Km值1.7 mmol/L,Vmax为3.8×104 U/mg;相对于NADH的Km值7.2 mmol/L,Vmax值为1.1×105 U/mg。Tm-LDH基因在T7载体中未能实现高效表达,但是在热激载体pHsh中得到了可溶性超量表达,表达水平达到340 mg/L。该酶在65℃反应条件下,活性达到最高活性的50%,并能保持活性不变,这使该酶能够与常温酶匹配,在辅酶NAD再生体系的建立中具有广泛的用途。     

Bacillus licheniformis6816碱性蛋白酶基因在E.coli中的克隆和表达

用PCR方法从地衣芽孢杆菌6816中扩增了碱性蛋白酶基因（apr),扩增的1.14kb的DNA片段插入到大肠杆菌载体pET-20b中,构建成重组分泌型表达载体pAPR1。pAPR1中碱性蛋白酶基因在大肠杆菌宿主JM109（DE3）中得到表达,SDS-PAGE分析显示融合表达产物的分子量为30kD,同核酸序列测定所推导的值相符,表达产物占细胞总蛋白的7.5%,重组菌的酶活比出发菌株提高了3.3倍,研究发现,重组的碱性蛋白酶在进入大肠杆菌周质空间时存在前肽自动脱落的现象。     

微生物来源的酶抑制剂研究进展

１９５８年,植物学家Ｋｏｈｌａｎｄ首先提出次生代谢的概念,１９６０年Ｂｕ’Ｌｏｃｋ把这一概念引进微生物学领域。微生物次生代谢物包括抗生素、色素、毒素、信息素、动植物生长促进剂和生物药物素（ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｎ）等。其中生物药物素包括酶抑制...     

大肠杆菌热休克或冷休克启动子调控的基因表达载体

基因重组技术已经成为获得各种酶和生物活性蛋白的主要手段。虽然很多基因已在大肠杆菌中得到高效表达,但是当人们认定某种蛋白对科学研究或生产应用极为重要时,却常常因为其基因表达水平很低或产生包涵体而感到束手无策。表达载体pHsh和pEXC通过激活热休克或冷休克转录调控机制提高分子伴侣的表达水平,从而降低目标蛋白的细胞毒性并减少包涵体形成。应用于生物合成、分子修饰或生物降解的高温酶可以通过pHsh系统表达获得高产,而科研和诊疗所需要的来源于动植物和常温微生物的基因可以通过pEXC系统获得高效表达。这些新载体的发展为重组蛋白的小规模制备和大规模生产提供了新策略和有效途径。     

白腐菌对染料脱色和降解作用的研究进展

白腐菌应用于废水处理始于二十世纪八十年代。本文对印染废水的处理方法、白腐菌及其对污染物的降解机理作了简要概述 ,着重介绍了白腐菌对染料脱色和降解作用的研究进展。白腐菌对染料的脱色解降作用机理有部分尚待进一步研究 ;同时 ,白腐菌的吸附作用亦不容忽视。     

Hsh载体对外源基因在E. coli中高效表达的机制探讨

pHsh是根据大肠杆菌的热休克反应构建而成的新型表达载体, 受σ32调控。正常E. coli细胞的整个热休克反应持续时间约12 min, 而在携带有外源基因的高拷贝pHsh的E. coli细胞中, 外源基因却能持续高效表达4?10 h。为探求外源基因高效表达的机制, 以一个编码木聚糖酶的外源基因为代表, 首先研究了质粒拷贝数对木聚糖酶表达的影响, 接着通过Western-blot检测了携带质粒pHsh-xynIII和对照组携带pLac-xynIII的E. coli细胞在非诱导条件下(30 °C)和诱导条件下(30 °C→42 °C)胞内σ32的差异, 最后测定了不同温度下(30 °C、37 °C、42 °C、30 °C→42 °C)携带质粒(pHsh-xynIII)的E. coli细胞内稳定状态下热休克的水平(以木聚糖酶活性表征)。研究结果表明外源基因在pHsh中的高效表达是与3个方面密切相关的: pHsh质粒的高拷贝数增加了外源基因的剂量; pHsh的存在使E. coli细胞内σ32的水平较正常E. coli细胞显著增加了, 并最终增强了E. coli的热休克反应; 诱导状态下带有pHsh重组质粒的E. coli细胞内稳定状态下的热休克水平明显高于其它温度的水平。     

巨大芽孢杆菌分子伴侣GroES和GroEL新基因的克隆及同源性分析

巨大芽孢杆菌作为革兰氏阳性细菌的一种,是良好的重组蛋白的表达宿主.本研究利用PCR技术从巨大芽孢杆菌基因组克隆出一条1.9 Kb的基因片段.核酸序列分析结果表明,该片段全长1 984 bp,包含2个ORF,分别与芽孢杆菌来源的GroES和GroEL基因有高度的相似性.氨基酸序列比对发现,GroES蛋白与枯草芽孢杆菌来源的GroES蛋白氨基酸序列同源性为91%,GroEL蛋白氨基酸序列同源性为90%.