细胞周期监控点蛋白Rad9与非同源末端连接修复蛋白Ku70的相互作用研究

Rad9是一种重要的细胞周期监控点调控蛋白．越来越多的证据显示,Rad9也可与多种DNA损伤修复通路中的蛋白质相互作用,并调节其功能,在DNA损伤修复中发挥重要作用．非同源末端连接修复是DNA双链断裂的一条重要修复途径．Ku70、Ku80和DNA依赖的蛋白激酶催化亚基(DNA-PKcs)共同组成DNA依赖的蛋白激酶复合物(DNA-PK),在非同源末端修复连接中起重要作用．本研究中,检测到Rad9与Ku70有直接的物理相互作用和功能相互作用．我们在不同的细胞模型中发现,Rad9基因敲除、Rad9蛋白去除或Rad9表达降低会导致非同源末端连接效率明显下降．已有的研究表明,DNA损伤可导致细胞中Ku70与染色质结合增加及DNA-PKcs激酶活性增强．我们的结果显示,与野生小鼠细胞相比,Rad9基因敲除的小鼠细胞中, DNA损伤诱导的上述效应均减弱．综上所述,我们的研究首次报道了Rad9与非同源末端连接修复蛋白Ku70间有相互作用,并提示Rad9可通过调节Ku70/Ku80/DNA-PKcs复合物功能参与非同源末端连接修复．     

DNA依赖蛋白激酶研究进展

DNA依赖蛋白激酶由Ku异二聚体和DNA-PKcs组成,结合Ku蛋白后,DNA-PK激酶活性激活,DNA依赖蛋白激酶具有多功能性,参与DNA修复、基因重组以及复制、转录等多种细胞学过程.     

DNA-PKcs基因沉默抑制人乳腺上皮细胞对低剂量辐射损伤的修复

DNA-PKcs作为DNA依赖性蛋白激酶(DNA-PK)的催化亚基在DNA双链断裂(DSBs)的非同源末端重组(NHEJ)通路中起重要的作用。本实验以人乳腺上皮细胞株MCF10F为研究对象,通过siRNA技术抑制细胞内DNA-PKcs的表达,用50cGy137CS照射细胞,测定细胞生长曲线以确定细胞对低剂量辐射(LDR)的敏感性,同时检测DNA修复相关蛋白表达的变化,旨在探讨DNA依赖蛋白激酶(DNA-PKcs)基因沉默对人乳腺上皮细胞株MCF10F低剂量辐射敏感性的影响及机制。结果显示:转染特异性siRNA可使人乳腺上皮细胞(MCF10F)DNA-PKcs基因沉默,增殖受到明显的抑制;50cGyγ射线辐射可使乳腺细胞内DNA-PKcs、Ku80、ATM、P53等DNA修复相关蛋白表达增多,但DNA-PKcs基因沉默细胞(MCF10Fpk)中,这些蛋白表达显著低于对照组(MCF10Fmock)。以上结果提示,DNA-PKcs基因沉默可引起乳腺细胞对低剂量辐射敏感性增加,其原因可能与相关DNA修复蛋白表达减少有关。     

与真核生物DSBs修复有关的NHEJ途径研究进展

DNA双链断裂是真核生物最严重的DNA损伤形式.如果断裂的DNA双链无法及时修复,将可能导致细胞死亡.非同源末端连接途径在真核生物DSBs修复中起重要作用.综述了真核生物NHEJ途径中核心蛋白质Ku、DNA-PKcs、DNA连接酶IV、XRCC4、ARTEMIS和XIF等因子的结构和功能,并简要介绍了NHEJ修复途径的分子机制,其中涉及到DSBs位点蛋白复合体组装的两种模型.     

DNA双链断裂的非同源末端连接修复

细胞内普遍存在的DNA双链断裂(DSB)可通过同源重组(HR)或非同源末端连接(NHEJ)修复。由于HR仅在存在相同染色体作为模板的时候进行,因此,NHEJ通常为主要的修复方式。在NHEJ中,DSB末端首先由Ku识别,接着由核酸酶、聚合酶在Ku与DNA-PKcs协助下加工,并由连接酶IVXRCC4-XLF连接。NHEJ底物类型多样,末端的修复常包含反复加工的过程,导致修复产物通常无法复原损伤前的序列。虽然无法确保准确修复DNA,NHEJ仍对维持基因组的稳定性具有重要的意义。对NHEJ的研究有助于理解癌症的发生机制并将促进癌症的治疗。     

Cmku70基因敲除对蛹虫草生长发育的影响

ku70和ku80是非同源末端连接修复通路的关键基因,在一些丝状真菌中其基因敲除株可作为底盘菌株,提高同源重组效率和基因敲除效率。本研究从蛹虫草基因组中鉴定得到Cmku70及Cmku80基因,分别编码分子量为71.50kDa和80.96kDa的蛋白,均含有Ku core结构域,预测均定位于细胞核。系统进化分析表明Ku70和Ku80蛋白在真菌中广泛存在,且具有保守性。通过农杆菌介导的同源重组法敲除Cmku70,发现不影响蛹虫草菌丝生长、见光转色、分生孢子形成及形态等无性生长过程,但敲除后不能形成子实体,因此Cmku70敲除株不宜用作蛹虫草生长发育相关基因高效敲除的底盘菌株。     

高质量抗体揭示Rad1蛋白在细胞中新的潜在活动机理（英文）

一组在进化上(从酵母到人)保守的基因Rad9、Rad1和Hus1在细胞周期监控点调控和DNA损伤修复中发挥重要作用.这三个蛋白可以形成环形异源三聚体,即9-1-1蛋白复合体.9-1-1复合体被认为是Rad9、Rad1和Hus1行使功能的主要形式.到目前为止,没有一个好的抗Rad1的抗体,严重阻碍了对Rad1和9-1-1复合体的研究.在本研究中,我们成功地制备了一株小鼠抗Rad1蛋白的单克隆抗体.这个抗体能够有效地检测小鼠和人的内源Rad1蛋白,可以用于酶联免疫吸附、蛋白质免疫印迹、免疫共沉淀和免疫荧光等实验.利用该抗体,我们发现在DNA损伤剂羟基脲(HU)的诱导下,小鼠Rad1蛋白在Rad9+/+小鼠胚胎干细胞中表达明显增加,而在Rad9-/-的小鼠胚胎干细胞中没有观察到该现象,这表明Rad9对Rad1的蛋白表达有调控作用.此外,内源的Rad1蛋白主要分布在细胞质中,在HU处理后并没有迁移进入细胞核的现象,这与先前广泛被人们所接受的在DNA损伤压力下Rad1和Hus1能够迁移进入细胞核并与Rad9形成9-1-1蛋白复合体的说法相矛盾.综合看来,Rad1和9-1-1蛋白复合体的分子作用机制比预期的要复杂,我们成功制备的Rad1单克隆抗体将成为研究Rad1以及9-1-1蛋白复合体的强有力的工具.     

c-Abl与应激损伤调控

非受体酪氨酸激酶c-Abl广泛表达于人和哺乳动物等的细胞中并受到严格调控,通过蛋白之间相互作用、与DNA相互作用及其酪氨酸激酶活性在一系列的重要生命活动中发挥调节作用。在应激损伤反应如DNA损伤反应中．c-Abl的Ser^465被ATM和DNA-PK磷酸化而激活,通过与Rad51、p53和p73等分子的相互作用参与DNA重组修复、细胞周期和细胞凋亡等的调控,不同信号途径之间的平衡决定细胞的生存和死亡。     

错配修复蛋白Tmlh1维持嗜热四膜虫细胞核的稳定性

DNA错配修复(DNA mismatch repair,MMR)蛋白Mlh1和其它因子形成多种不同的复合物,在DNA复制后的MMR途径和减数分裂DNA重组中发挥重要作用。然而对Mlh1的功能并不完全清楚,进一步分析Mlh1在不同进化地位生物中的功能具有重要意义。嗜热四膜虫(Tetrahymena thermophila)含有不同的错配修复复合物,基因表达谱分析发现,MutL复合物中的TMLH1(TTHERM_00127000)在营养生长期和饥饿期低水平表达,在有性生殖减数分裂期表达水平显著上调。免疫荧光定位显示营养生长期,Tmlh1定位于生殖系小核和转录活跃的大核;有性生殖期,定位于功能性小核和亲本大核,但在凋亡的大核和小核中消失。在减数分裂和有丝分裂时期,Tmlh1和α-微管蛋白(α-tubulin)存在共定位;而有性生殖后期,Tmlh1与异染色质蛋白Pdd1共定位于DNA删除的异染色结构域。TMLH1敲除细胞增殖速率降低,DNA损伤修复抑制,导致有性生殖细胞配对率降低和微核形成。1 mmol/L甲基甲磺酸甲酯(methy methanesulfonate, MMS)处理下,ΔTMLH1细胞传代时间增加了4.53%±0.35%,而野生型细胞传代时间增加了0.60%±0.14%。TMLH1敲除突变细胞株小核上呈现强烈的γ-H2A.X的荧光信号。免疫共沉淀和蛋白质谱分析发现,Tmlh1同微管蛋白、错配修复因子MutS、同源重组修复关键因子Rad51,非同源末端修复因子Ku80因子等存在相互作用。这些结果表明,嗜热四膜虫错配修复蛋白Tmlh1通过多种途径参与DNA修复和基因组重排,从而维持四膜虫生长发育和有性生殖过程中细胞核的稳定性。     

c-Myc蛋白与DNA-PKcs作用位点的鉴定

DNA-PK复合物由Ku蛋白和DNA依赖蛋白激酶催化亚基(DNA-PKcs)组成,DNA-PKcs属于PI3K相关激酶家族成员.我们前期工作发现,DNA-Kcs沉默后,c-Myc的稳定性下降,且二者存在相互作用.为进一步确定c-Myc蛋白与DNA-PKcs相互作用位点,本研究利用原核表达系统活动了c-Myc及其截短体蛋白,利用GST pull-down技术结合Western印迹法,发现c-Myc蛋白294～370位氨基酸与DNA-PKcs存在相互作用.在细胞内表达GFP-c-Myc各截短体蛋白,发现294～370位氨基酸是c-Myc蛋白降解必需的.利用免疫荧光技术,发现DNA-PKcs与c-Myc蛋白有相同的细胞亚定位,进一步表明两者在生物学功能上具有相关性.有文献报道294～370位氨基酸是乙酰转移酶p300的底物,此位点的乙酰化导致c-Myc的降解.本实验结果提示,c-Myc蛋白的294～370位氨基酸与DNA-PKcs结合,可能阻止了乙酰转移酶p300的结合,从而达到提高c-Myc蛋白稳定性的作用.     

乙酰化修饰降低Ku蛋白的DNA结合活性

【目的】研究乙酰化修饰对Ku蛋白活性的影响。【方法】利用耻垢分枝杆菌为表达菌株,转入Ku蛋白表达质粒,纯化具有乙酰化修饰的Ku蛋白和无乙酰化的Ku蛋白突变体,比较两类蛋白的生化活性;分析氧化压力和酸性环境下耻垢分枝杆菌细胞内Ku蛋白乙酰化水平的变化。【结果】Ku蛋白过量表达的耻垢分枝杆菌比转入空质粒的对照菌株生长缓慢;乙酰化Ku蛋白比未发生乙酰化Ku蛋白修复断裂DNA的活性降低、DNA结合活性降低;氧化压力和酸性压力环境下,耻垢分枝杆菌细胞内Ku蛋白数量降低,乙酰化Ku蛋白数量变化不大。【结论】乙酰化修饰能够调节Ku蛋白的DNA结合活性,从而调节非同源末端连接修复系统的活性;Ku蛋白乙酰化程度升高是耻垢分枝杆菌对不良生长环境的反应。     

泛素载体蛋白Rad6在基因表达调控及DNA损伤修复中的作用

泛素化修饰是蛋白质的一种重要的翻译后水平修饰,而且有着多种不同的生物学功能,对蛋白质的结构与功能、基因表达调控以及蛋白质-蛋白质/其它分子相互作用等多个方面有着重要的调控作用。Rad6即是酵母中的一种重要的泛素载体蛋白。Rad6通过泛素化修饰多种靶蛋白在DNA的损伤修复中发挥着重要作用。文章重点讨论了Rad6在DNA损伤修复方面的功能以及在正常情况下对染色质结构和基因表达调控的影响。     

靶向Rad51与肿瘤治疗的研究进展

DNA损伤反应在维持细胞基因组稳定性和机体存活发挥重要作用。DNA双链断裂(Double strand breaks,DSBs)是DNA损伤最严重的形式。同源重组修复是体内参与DSBs损伤修复的重要机制之一,其中Rad51是体内参与同源重组性DNA修复的关键因子。Rad51在人类的多种肿瘤组织中高表达,如乳腺癌、非小细胞肺癌、前列腺癌等,与肿瘤的转移和恶化相关。如何有效下调肿瘤组织中的Rad51的水平,降低肿瘤细胞的DNA损伤修复能力,从而提高肿瘤治疗的疗效具有潜在的临床应用价值。本文对近年来的一个研究热点靶向Rad51在肿瘤治疗研究中的应用进行综述。     

DNA双链断裂修复与重症联合免疫缺陷

DNA双链断裂(double-strand breaks, DSBs)是细胞DNA损伤的主要类型,它的修复通过同源重组(HR)和非同源末端连接(NHEJ)两种机制实现.NHEJ是人和哺乳动物细胞DSBs修复的重要通路,主要由DNA依赖性蛋白激酶(DNA-PK)、X射线修复交叉互补蛋白4(XRCC4)、DNA连接酶Ⅳ、Artemis、XLF/Cernunnos和其它DNA损伤修复辅助因子组成.本文重点介绍了NHEJ机制主要成分的特性及其功能,以及这些组分的基因发生突变或缺失所引起的DSBs修复缺陷与辐射敏感性重症联合免疫缺陷(radiosensitive severe combined immunodeficiencies, RS-SCIDs).     

高质量抗体揭示Rad1蛋白在细胞中新的潜在活动机理

一组在进化上(从酵母到人)保守的基因Rad9、Rad1和Hus1在细胞周期监控点调控和DNA损伤修复中发挥重要作用．这三个蛋白可以形成环形异源三聚体,即9-1-1蛋白复合体．9-1-1复合体被认为是Rad9、Rad1和Hus1行使功能的主要形式．到目前为止,没有一个好的抗Rad1的抗体,严重阻碍了对Rad1和9-1-1复合体的研究．在本研究中,我们成功地制备了一株小鼠抗Rad1蛋白的单克隆抗体．这个抗体能够有效地检测小鼠和人的内源Rad1蛋白,可以用于酶联免疫吸附、蛋白质免疫印迹、免疫共沉淀和免疫荧光等实验．利用该抗体,我们发现在DNA损伤剂羟基脲(HU)的诱导下,小鼠Rad1蛋白在Rad9^+/+小鼠胚胎干细胞中表达明显增加,而在Rad9^-/-的小鼠胚胎干细胞中没有观察到该现象,这表明Rad9对Rad1的蛋白表达有调控作用．此外,内源的Rad1蛋白主要分布在细胞质中,在HU处理后并没有迁移进入细胞核的现象,这与先前广泛被人们所接受的在DNA损伤压力下Rad1和Hus1能够迁移进入细胞核并与Rad9形成9-1-1蛋白复合体的说法相矛盾．综合看来,Rad1和9-1-1蛋白复合体的分子作用机制比预期的要复杂,我们成功制备的Rad1单克隆抗体将成为研究Rad1以及9-1-1蛋白复合体的强有力的工具．     

征服癌症的双刃刀--Rad51 D蛋白

人类Rad5l蛋白是同源重组的关键酶,发挥着链转移或链交换活性,启动DNA同源配对的作用。Rad51D蛋白是Rad51蛋白的5种同源物之一,对细胞调节有正反两种作用机制一方面作为辅助因子参与DNA修复同源重组,维持正常细胞周期;另一方面又是诱发癌症病变,防止癌细胞衰老的因素之一。Rad51D蛋白对细胞的作用机制,是人类征服癌症的双刃刀,如果阻止癌细胞的Rad51D蛋白作用可以促进癌细胞的死亡;而同时Rad51D蛋白作用的减弱将使细胞发生周期紊乱,产生新的病变。本文将近年来有关Rad51D的研究成果进行了整理,主要包括Rad51D蛋白的生物学特征和生物学功能两部分,同时对Rad51D蛋白的研究方向提出了自己的看法。     

植物转基因座位形成的分子机制

转基因座位是指染色体上插入的转基因及相邻的特定DNA序列。大多数转基因座位是以转基因片段、基因组片段和填充DNA相间而存在,仅少数含有完整的单拷贝转基因,这是由于在转基因整合过程中,转基因及基因组DNA发生缺失、重复和染色体的重排。转基因整合主要通过双链DNA断裂修复中的异常重组所产生,而同源重组也发挥了一定的作用。异常重组主要由单链复性、合成依赖链复性和依赖Ku蛋白的非同源末端连接途径调节。     

原核生物的NHEJ修复途径

DNA双链断裂(DSBs)是严重的DNA损伤形式之一,生物体对DSBs的修复可通过同源重组(HR)或非同源末端连接途径(NHEJ)进行。长期以来,人们普遍认为HR是细菌DSBs修复的惟一途径,但在分支杆菌和其它原核生物体内NHEJ途径的发现,使这一观念得以颠覆。最近的研究表明,细菌NHEJ修复系统是一个双组分系统,包含一个多功能的DNA连接酶(LigD)和DNA末端结合蛋白Ku,具有DSBs修复所需的断裂末段识别、末端加工和连接活性。重点综述细菌NHEJ修复系统的组成、结构以及生理功能。     

Ku70基因稳定敲除HeLa细胞株的建立及其生物学功能研究

目的:利用CRISPR/Cas9技术构建人Ku70基因稳定敲除的HeLa细胞株,并检测其生物学功能。方法:设计并构建向导RNA载体p Cas-g RNA和同源重组供体DNA载体p Back Zero-T-Ku70,2种重组质粒共转染HeLa细胞,加入潮霉素B进行抗性筛选,通过基因组PCR和Western印迹检验Ku70基因是否被敲除;进而,选择Ku70稳定敲除的细胞株,分别采用CCK-8和Transwell实验检测细胞增殖和迁移能力;此外,提取细胞总RNA,反转录成c DNA后用荧光定量PCR仪检测5种miRNA(hsa-miR-649、hsa-miR-544a、hsa-miR-562、hsa-miR-548a、hsa-miR-492)的表达水平。结果:g RNA表达质粒p Cas-g RNA和DNA供体质粒p Back Zero-T-Ku70构建成功;2种重组质粒共转染HeLa细胞,基因组PCR扩增出特异的基因重组DNA片段,Western印迹结果显示Ku70蛋白已基本无表达。细胞增殖和迁移实验显示敲除Ku70基因的HeLa细胞增殖和迁移能力均有所减弱。q RT-PCR结果显示,敲除Ku70基因致hsa-miR-649、hsa-miR-544a和hsa-miR-562水平有所升高,而hsa-miR-548a和hsa-miR-492水平未有明显变化。结论:获得Ku70基因稳定敲除的细胞株;Ku70蛋白可能参与了HeLa细胞增殖和迁移过程;其还可能调节部分miRNA的表达。     

ATP依赖型染色质重塑复合物在DNA双链断裂修复中的作用

DNA双链断裂修复缺陷易导致细胞基因组稳定性失衡、细胞发生癌变或死亡。真核生物主要通过同源重组和非同源末端连接两条途径来修复双链断裂。近年来发现多种ATP依赖型的染色质重塑蛋白复合物,包括RSC、INO80、Fun30、SWI/SNF和SWR1,直接参与了DNA双链断裂修复过程。它们主要通过调控DNA损伤检查点激活、断裂末端剪切及组蛋白H2AZ-H2B/H2A-H2B置换等重要步骤发挥功能。现以酿酒酵母中的研究为重点,综述主要ATP依赖型染色质重塑复合物在DNA双链断裂修复中的功能及作用机制。