利用SpyTag/SpyCatcher构建胞内自组装多酶复合体实现高效生物合成

SpyTagr和SpyCatche可通过自发反应形成共价键,产生稳定的分子自组装体。酶分子自组装体因具有高效有序的催化特性在合成生物学和纳米技术领域具有重要的应用价值。为探索SpyTag/SpyCatcher在大肠杆菌胞内多酶复合体系形成有序自组装分子能力,将SpyTagr和SpyCatche分别与P450BM3m单加氧酶和葡萄糖脱氢酶GDH进行融合表达,以期产生具有辅酶再生循环系统、高效生物合成靛蓝分子的SpyTag/SpyCatcher双酶自组装复合体。首先,通过电泳及质谱对重组工程菌表达蛋白进行分析,证实SpyCatcher-P450BM3m与SpyTag-GDH在胞内成功形成了自组装多酶复合体;然后,系统分析不同培养条件下组装体合成靛蓝的能力。结果发现,经0.5mmol/L IPTG诱导后,菌体在16℃继续培养18h后,工程菌对吲哚(2mmol/L)与葡萄糖(4mmol/L)的全细胞催化能力最强,靛蓝产量最高达258mg/L,是未组装多酶系统的1.9倍,比P450BM3m单酶表达系统高约2.4倍;反应70min后达到反应平衡,转化率为52%。成功实现了SpyTag/SpyCatcher介导的多酶体系在大肠杆菌细胞中的自组装和高效转化体系,为胞内多酶复合物组装体的设计提供了新思路。     

蛋白质自组装机器在人工多酶复合体系中的研究与应用进展

随着合成生物学的研究与发展,人们利用微生物细胞或无细胞体系对代谢途径中的多酶体系进行编程和重组,成功合成了大量的功能化合物。但由于多酶体系分散度高,造成体系代谢流速和流量不平衡,代谢效率和产量降低。生物体内存在多种天然的多酶自组装复合体,如纤维素小体机器、细胞信号转导中的激酶级联通路等。研究表明,这些体系中存在的底物通道效应和协同作用机制是多酶复合体具有高催化效率的原因。模拟和借鉴天然多酶体系,并结合生物体中蛋白质与DNA、RNA等相互作用设计和构建人工自组装多酶体系,是提高代谢效率的重要途径。现对蛋白质自组装机器在人工多酶体系中的研究进展进行综述。     

不同镇静深度静吸复合麻醉对老年腹腔镜腹部手术患者术后认知功能的影响比较

目的:比较不同镇静深度静吸复合麻醉对老年腹腔镜腹部手术患者术后认知功能的影响。方法:选择我院2014年3月-2015年3月90例拟择期行腹部手术的老年患者随机分为A、B、C三组,每组30例,采用不同深度静吸复合麻醉,根据BIS指数调节七氟醚浓度和瑞芬太尼输注速率,其中A组维持BIS值水平51-60,B组维持BIS值水平41-50,C组维持BIS值水平31-40,于术前1d和术后1 d对患者认知功能进行测评。结果:各组麻前1 d A组TMT完成时间和MMSE评分比较差异无显著性(P0.05)。A组术后24 h认知功能下降发生率为30.0%,B组术后24 h认知功能下降发生率为23.33%,C组认知功能下降发生率为16.67%,C组与A组比较差异具有显著性(P0.05)。C组TMT完成时间和MMSE评分差值均低于A组B组,但各组内和组间比较差异无显著性(P0.05)。结论:深度麻醉对老年腹腔镜腹部手术患者早期术后认知功能影响较小。     

类缺血等多种预处理上调脂多糖应答基因在神经元中的表达

目的:研究体外和体内多种预处理对小鼠神经元细胞内脂多糖应答基因(LRG)表达的影响。方法:利用qRT-PCR和western blot方法检测体外多种预处理(类缺血、高压氧、异氟和脂多糖)对小鼠神经元细胞中LRG的转录水平和蛋白表达水平的影响;运用小RNA干扰方法(siRNA)沉默神经元细胞中LRG的表达,噻唑蓝(MTT)方法检测神经元细胞的生长情况;运用大脑中动脉阻闭法(MCAO)建立多种预处理诱导脑缺血耐受的小鼠试验模型,qRT-PCR和western blot方法检测小鼠脑组织中LRG转录水平和蛋白水平的变化。结果:体外多种预处理明显上调LRG在小鼠脑海马神经元细胞中的表达;沉默LRG在神经元中的表达明显加快类缺血处理细胞的死亡;多种预处理建立的脑缺血耐受小鼠的脑组织中LRG转录水平和蛋白表达水平明显升高。结论:类缺血等多种预处理可上调神经元细胞内LRG的表达,但其在脑缺血再灌注损伤中的作用机制尚不清楚,需进一步的研究。     

原核生物的NHEJ修复途径

DNA双链断裂(DSBs)是严重的DNA损伤形式之一,生物体对DSBs的修复可通过同源重组(HR)或非同源末端连接途径(NHEJ)进行。长期以来,人们普遍认为HR是细菌DSBs修复的惟一途径,但在分支杆菌和其它原核生物体内NHEJ途径的发现,使这一观念得以颠覆。最近的研究表明,细菌NHEJ修复系统是一个双组分系统,包含一个多功能的DNA连接酶(LigD)和DNA末端结合蛋白Ku,具有DSBs修复所需的断裂末段识别、末端加工和连接活性。重点综述细菌NHEJ修复系统的组成、结构以及生理功能。     

黑曲霉Aspergillus niger 963植酸酶基因phyA2 N-糖基化突变体的构建与表达分析

为研究N-糖基化对黑曲霉Aspergillus niger963植酸酶蛋白酶学性质的影响,利用Megaprimer PCR介导基因定点突变的技术,构建了植酸酶phyA2基因两个N-糖基化突变体,即将该基因编码蛋白质N87位和N102位的天冬酰胺密码子置换为编码与其具有相似结构的谷氨酰胺密码子,两个突变体分别命名为N87Q、N102Q,经测序结果比对和图谱分析,表明在核酸水平上成功实现了点突变,构建了酵母表达载体pPIC9-N87Q,pPIC9-N102Q,转化毕赤酵母GS115,经发酵罐水平诱导表达后,获得了N-糖基化缺失突变蛋白,对突变体蛋白在60℃进行处理发现,突变体N87Q处理1h后剩余50%的酶活,N102Q处理10min后酶活完全丧失,在37℃,不同的pH缓冲体系(pH1~10)处理1h,N87Q剩余约大于70%的活性,而N102Q在pH8的环境下,没有检测到酶活。