Vasorin基因稳定敲除HepG2细胞株的建立及其生物学功能研究

目的:利用CRISPR/Cas9技术建立人Vasorin(VASN)基因稳定敲除的HepG2细胞株,并研究VASN蛋白对细胞增殖和迁移等生物学功能的影响。方法:根据人VASN序列设计向导RNA,将其克隆至表达载体pCas-Guide,获得质粒pCas-gRNA;PCR扩增VASN编码基因左、右同源臂及潮霉素B抗性基因,通过重叠PCR将三者拼接为一条片段,并克隆至载体pBackZero-T,获得质粒pBackZero-T-VASN;上述2种重组质粒共转染HepG2细胞,经潮霉素B筛选,通过基因组PCR、RT-q PCR和Western印迹实验检测VASN基因是否被敲除。利用CCK-8法和Transwell法检测VASN稳定敲除细胞株的增殖和迁移能力。结果:向导RNA表达质粒pCas-gRNA和DNA供体质粒pBackZero-T-VASN构建成功;基因组PCR结果显示,潮霉素B基因正确重组至VASN基因中;RT-PCR显示VASN m RNA水平显著降低,Western免疫印迹结果显示VASN蛋白表达水平显著降低;VASN稳定敲除细胞株的增殖和迁移能力比野生型细胞明显减弱。结论:构建了pCas-gRNA和pBackZero-T-VASN质粒,获得了VASN缺失的细胞株,验证了VASN蛋白参与细胞的增殖和迁移过程,为深度探讨VASN的生物学功能及其分子机制奠定了基础。     

Ku70基因稳定敲除HeLa细胞株的建立及其生物学功能研究

目的:利用CRISPR/Cas9技术构建人Ku70基因稳定敲除的HeLa细胞株,并检测其生物学功能。方法:设计并构建向导RNA载体p Cas-g RNA和同源重组供体DNA载体p Back Zero-T-Ku70,2种重组质粒共转染HeLa细胞,加入潮霉素B进行抗性筛选,通过基因组PCR和Western印迹检验Ku70基因是否被敲除;进而,选择Ku70稳定敲除的细胞株,分别采用CCK-8和Transwell实验检测细胞增殖和迁移能力;此外,提取细胞总RNA,反转录成c DNA后用荧光定量PCR仪检测5种miRNA(hsa-miR-649、hsa-miR-544a、hsa-miR-562、hsa-miR-548a、hsa-miR-492)的表达水平。结果:g RNA表达质粒p Cas-g RNA和DNA供体质粒p Back Zero-T-Ku70构建成功;2种重组质粒共转染HeLa细胞,基因组PCR扩增出特异的基因重组DNA片段,Western印迹结果显示Ku70蛋白已基本无表达。细胞增殖和迁移实验显示敲除Ku70基因的HeLa细胞增殖和迁移能力均有所减弱。q RT-PCR结果显示,敲除Ku70基因致hsa-miR-649、hsa-miR-544a和hsa-miR-562水平有所升高,而hsa-miR-548a和hsa-miR-492水平未有明显变化。结论:获得Ku70基因稳定敲除的细胞株;Ku70蛋白可能参与了HeLa细胞增殖和迁移过程;其还可能调节部分miRNA的表达。     

miR-23b通过靶定TAB2/3抑制糖尿病肾病纤维化

MicroRNAs(miRNAs)通过与靶基因的相互作用发挥其生物学功能. miR-23b作为抑癌基因,参与了许多肿瘤和自身免疫疾病的发生过程,但其在糖尿病肾病中的作用尚不清楚.为了探讨miR-23b与靶基因TAB2/3作用对糖尿病肾病纤维化的影响,本实验通过建立糖尿病小鼠模型和糖尿病HK-2细胞模型,利用实时定量荧光PCR方法,检测糖尿病小鼠模型肾mRNA表达,发现miR-23b在糖尿病组（Dia组）表达低于正常组（P<0.001）.利用Western印迹检测相关蛋白,结果显示,与正常组相比,TAB2/3,FN和α-SMA在糖尿病组高表达,并且TAB2/3在糖尿病组中持续高表达.利用基因转染技术过表达miR-23b可以同时在mRNA和蛋白水平上抑制TAB2/3,P38和ERK1/2的表达,FN表达也显著降低.以上结果显示：miR-23b可能通过作用靶基因TAB2/3及其信号通路下游,抑制糖尿病肾病纤维化.