双链RNA病毒诱导的牙鲆胚胎细胞差减cDNA文库的构建

以紫外线灭活的dsRNA病毒草鱼出血病病毒(GCHV)诱导和模拟诱导的牙鲆胚胎细胞为材料,利用抑制性差减杂交(SSH)技术,成功构建了双链RNA病毒诱导的牙鲆胚胎细胞(FEC)差减cDNA文库.以管家基因α-tublin作为差减指标,经检测,该文库差减效率达2 10倍,表明经病毒诱导后某些差异表达基因也得到了相应倍数的富集.将获得的cDNA片段连接到pGEM-T载体,PCR检测显示差减片段在250bp～2 000bp之间.该差减cDNA文库的构建为从分子水平研究牙鲆培养细胞对dsRNA病毒的免疫反应、以及进一步鉴定和克隆差异表达基因打下了坚实基础.     

牙鲆CA/GT微卫星标记的筛选

采用生物素选择杂交法与放射性同位素杂交法相结合的技术,成功地从牙鲆(Paralichthys olivaceus)基因组中分离出含有CA/GT重复类型的微卫星序列。通过两轮淘选,共获得526个阳性菌落。测序其中的119个菌落,结果获得133个含有微卫星座位的序列。除了两个复合型微卫星外(1.5%),完美型63个(47.37%),非完美型68个(51.13%)。设计并合成22对微卫星引物,对8个人工雌核发育家系的亲本进行遗传背景分析。PCR结果表明,4对引物无扩增带或者扩增带不是目的条带,1对引物表现为单态,其余17对引物均呈多态性,平均每个座位产生5.2个复等位基因,杂合度为0.375～0.846,多态信息含量为0.305～0.823。结果表明,所筛选的大部分微卫星标记能够用于牙鲆群体遗传学研究。     

不同添加方式植酸酶处理豆粕对牙鲆生长和饲料利用率的影响

以初始平均体重(2.02±0.02)g的牙鲆(Paralichthys olivaceus)为实验对象,进行为期70d的摄食生长实验,研究不同添加方式的植酸酶对牙鲆生长和饲料利用的影响。在5000.0g豆粕中添加2.5g植酸酶,然后用产朊假丝酵母(Candidautilis)进行发酵预处理,得到植酸酶预处理豆粕。共制作4种等氮等能(粗蛋白49.7%、总能20.9kJ/g)饲料,对照饲料主要以鱼粉为蛋白源;在对照饲料的基础上,用豆粕蛋白替代45%的鱼粉蛋白配制成豆粕组饲料;在每千克豆粕组饲料中添加1000IU植酸酶,配制成植酸酶组饲料;用植酸酶预处理豆粕蛋白替代45%的鱼粉蛋白配制成植酸酶预处理豆粕组饲料。结果表明,与对照组相比较,用豆粕蛋白替代饲料中45%的鱼粉蛋白,若不添加植酸酶则显著降低牙鲆的特定生长率(P0.01)、饲料效率、蛋白质效率和氮贮积率(P0.05);直接添加植酸酶组、植酸酶预处理豆粕组牙鲆的特定生长率、饲料效率、蛋白质效率和氮贮积率与鱼粉对照组相比较没有出现显著差异(P0.05);与不添加植酸酶的豆粕组相比较,在含豆粕饲料中添加1000IU/kg饲料的植酸酶显著提高牙鲆的特定生长率(P0.01)、氮贮积率(P0.05)和磷贮积率(P0.01),显著降低氮排放率(P0.05)和磷排放率(P0.01),但饲料效率和蛋白质效率没有显著变化(P0.05);在豆粕中添加植酸酶进行发酵预处理,降低了豆粕中植酸含量,在饲料中添加植酸酶预处理豆粕显著提高牙鲆的特定生长率(P0.01)、饲料效率、蛋白质效率和氮贮积率(P0.05),显著降低氮(P0.05)、磷和钙的排放率(P0.01)。       

迟缓爱德华菌抗独特型单克隆抗体的制备及鉴定

迟缓爱德华菌(Edwardsiella tarda)是肠杆菌科爱德华菌属的一种条件致病菌,可引起败血病,危害鲆、鲤等经济养殖鱼类。但是,经过20余年的研究,虽有各种灭活疫苗和组分疫苗的试验,却无针对该菌病的商品化疫苗的使用报道。抗独特型抗体疫苗技术已成功用于肿瘤、细菌、病毒、寄生虫的防治,具有安全、易大规模生产等优点。鉴于药物防治鱼菌病的局限性,作者在制备了抗迟缓爱德华菌单克隆抗体的基础上,制备抗该菌的抗独特型单克隆抗体,用该菌抗独特型抗体免疫牙鲆, 为预防该菌病提供一种安全有效的新方法。       

大豆低聚糖对牙鲆营养效应的研究：I摄食、生长和代谢酶活性

本试验比较研究了不同蛋白源（鱼粉,FM;大豆分离蛋白,SPI）基础饲料中添加大豆低聚糖（SBOS）对牙鲆（Paralichthysolivaceus）摄食率、生长性能和代谢酶活性的影响。分别以FM、SPI作为主要蛋白源,配制了4种等氮等能饲料。其中,饲料FM、SP1分别以FM、SPI作为主要蛋白源;饲料FMO、SPIO分别在饲料FM、SPI基础上添加10％SBOS（水苏糖：2．61％;棉籽糖：0．61％）。试验表明：①饲料中添加SBOS对牙鲆前两周摄食丰无显著影响（P〉0．05）;而显著降低了整个养殖周期FMO组牙鲆总摄食率,提高了SPIO组牙鲆总摄食牢（P〈0．05）;②FM基础饲料中添加SBOS对牙鲆特定生长率（SGR）、饲料效率（FER）和蛋白质效率（PER）均无显著影响（P〉0．05）,但均呈明显下降趋势;SPI基础饲料中添加SBOS对FER和PER无显著影响,却显著提高了SGR（P〈0．05）;③FM基础饲料中添加SBOS提高了牙鲆血浆谷草转氨酶（AST）、谷丙转氨酶（ALT）、碱性磷酸酶（AKP）、乳酸脱氢酶（LDH）和γ-L-谷氨酰转肽酶（γ-GT）的活性,但仅AST差异显著（P〈0．05）,而对肝脏AST、ALT、AKP、LDH和1．GT活性无显著影响（P〉0．05）;SPI基础饲料中添加SBOS显著提高了血浆ALT和LDH活性,而对AST、AKP和γ-GT活性无显著影响;同时,SPI基础饲料中添加SBOS显著提高了肝脏AST和ALT活性,而对AKP、LDH和γ-GT活性无显著影响;④饲料巾添加SBOS对牙鲆血浆中尿素氮和游离氨基酸浓度均无显著影响。试验结果表明,不同蛋白源基础饲料中添加SBOS表现出不同的生长效应;其中,FM基础饲料中添加SBOS表现出一定的抑制生长效应,而SPI基础饲料中添加SBOS却表现出促生长效应。     

大豆低聚糖对牙鲆营养效应的研究：II消化率和消化生理

本试验比较研究了不同蛋白源（鱼粉,FM;大豆分离蛋白,SPI）基础饲料中添加大豆低聚糖（SBOS）对牙鲆（Paralichthys olivaceus）消化道（胃、幽门盲囊、前肠、中肠和后肠）和肝脏消化酶活性、饲料表观消化率和消化道（胃、小肠）组织结构的影响。分别以FM、SPI作为主要蛋白源,配制了4种等氮等能饲料。其中,饲料FM、SP1分别以FM、SPI作为主要蛋白源;饲料FMO、SPIO分别在饲料FM、SPI基础上添加10％SBOS（水苏糖：2．61％;棉籽糖：0．61％）。试验表明：①饲料中添加SBOS普遍降低了牙鲆消化道和肝脏蛋白酶活性,但差异均不显著（P〉O．05）。FM基础饲料中添加SBOS显著降低了肝脏脂肪酶活性（P〈0．05）,而对消化道脂肪酶活性无显著影响;SPI基础饲料中添加SBOS显著提高了前肠脂肪酶活性,降低了胃和中肠脂肪酶的活性,而对幽门盲囊、后肠和肝脏脂肪酶活性均无显著影响。FM基础饲料中添加SBOS显著降低了中肠淀粉酶活性,提高了胃淀粉酶活性（P〈0．05）,而对幽门盲囊、前肠、后肠和肝脏淀粉酶活性无显著影响;SPI基础饲料中添加SBOS显著提高了胃和前肠淀粉酶活性,降低了中肠脂肪酶活性（P〈0．05）,而对幽门盲囊、后肠和肝脏淀粉酶活性无显著影响;②FM基础饲料中添加SBOS显著降低了饲料干物质表观消化率（P〈0．05）,而对粗蛋白、粗脂肪和能量表观消化率均无显著影响（P〉0．05）。SPI基础饲料中添加SBOS对干物质、粗蛋白、粗脂肪和能量表观消化率均无显著影响;③饲料中添加SBOS对牙鲆胃和小肠组织结构均无明显负面影响。试验结果表明,饲料中添加SBOS对牙鲆消化道和肝脏消化酶活性、饲料表观消化率和消化道组织结构均没有表现出明显的负面效应;大豆蛋白源中含有的SBOS不是影响牙鲆对其利用率差的主要因素。     

环丙沙星预先处理牙鲆消化道对干酪乳杆菌定植的影响

利用1株干酪乳杆菌,通过实验研究用环丙沙星预先处理牙鲆消化道后乳杆菌的定植和演替规律。在投喂含有1.2×10^9CFU/g乳杆菌的饲料5 d后,消化道定植的乳杆菌超过106CFU/g,其后维持在10^6～10^8CFU/g动态平衡中。同时随着乳杆菌的投喂,不经环丙沙星预先处理牙鲆消化道的正常组,鱼消化道的弧菌数从10^7～8CFU/g降低到10^6CFU/g左右;而经环丙沙星预先处理牙鲆消化道的药饵组,鱼胃、小肠和盲囊的弧菌数则是先增加,然后显著下降。停喂乳杆菌7 d后,2个实验组鱼消化道的乳杆菌均从10^5～6CFU/g下降到10^4CFU/g,干酪乳杆菌正常组鱼盲囊中弧菌从10^5CFU/g回升到10^6CFU/g,胃和小肠中弧菌数量基本不变。干酪乳杆菌药饵组则有所不同：除胃中弧菌数量则基本不变外,盲囊和小肠中弧菌数量继续下降,其原因有待进一步研究。实验结果表明,干酪乳杆菌能在牙鲆消化道内定植,而用预先处理牙鲆消化道后,更有利于乳杆菌的定植;乳杆菌的投喂和定植,使牙鲆消化道中的弧菌数量明显下降。     

牙鲆淋巴细胞转化和细胞免疫

利用淋巴转化实验测试了抗原和有丝分裂原对牙鲆T淋巴细胞的影响。结果显示在适宜的生长温度范围内,低温延缓或阻止牙鲆细胞免疫应答的发生,导致淋转水平下降。外周血和脾淋巴细胞非特异性淋转水平较前肾高,外周血和脾淋巴细胞的淋转水平没有显著差异。这可能和外周血、脾和前肾中T细胞占淋巴细胞的比例有关。外周血较脾和前肾特异性淋转水平高,而前肾的淋巴细胞转化水平较脾高,注射引起牙鲆应激反应导致淋转水平升高。     

牙鲆变态中IGF-I基因表达及甲状腺激素对其的调节作用

胰岛素样生长因子(Insulin-like growth factors,IGFs)是一类具有胰岛素样代谢和促有丝分裂功能的蛋白质,参与脊椎动物的胚胎发育、生长和生殖。IGF系统包括两个配体(IGF-Ⅰ、IGF-Ⅱ)、IGF受体(IGF-I receptor,IGF-I R;IGF-II receptor,IGF-ⅡR)以及IGF结合蛋白(IGF binding