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1.
人睫状神经营养因子的原核表达,纯化及其生物效应 总被引:2,自引:0,他引:2
人睫状神经营养因子(hCNTF)克隆入pBV220中,在DH5α菌株中表达,重组蛋白以包含体的形式存在,表达量为菌体总蛋白的50%左右。经比较发现用2mol/L脲洗涤包含体可溶解大量可溶性细菌蛋白,且包含体损失较小。在高浓度变性剂条件下进行sepharcylS-200凝胶过滤,解决了纯化中hCNTF易聚合的问题,在低浓度变性剂条件下进行DEAE离子交换,有利于蛋白活性的保持。经两步纯化后得到均一性hCNTF,纯度达95%以上。在自然状态下使hCNTF复性。纯化复性后的hCNTF对无血清培养的鸡胚背根节神经元和脊髓腹角运动神经元有明显的维持存活和促进生长发育的生物效应。 相似文献
2.
3.
为研究鸭C4结合蛋白(C4b-binding protein,C4BP)与鸭疫里默氏菌(Riemerella anatipestifer,RA)的相互作用,对鸭C4BPα进行克隆、原核表达,免疫小鼠制备多克隆抗体,并利用间接免疫荧光试验及斑点杂交试验验证C4BP与RA的相互作用。结果显示,鸭C4BPα核苷酸序列全长为1230bp,与鸡C4BPα的相似性最高(82.1%);系统进化树分析发现,鸭C4BPα与鸡C4BPα处于同一系统进化树分支上,两者遗传进化关系最近;C4BPα在大肠杆菌Escherichia coli BL21 (DE3)中能高效表达,重组蛋白以胞内可溶性形式存在;多克隆抗体效价超过1∶10000,并且可以与重组蛋白发生特异性反应;间接免疫荧光试验和斑点杂交试验结果显示RA与鸭C4BP可以发生相互作用。研究结果为进一步揭示RA的致病机制奠定了基础。 相似文献
4.
5.
柽柳翻译起始因子(eIF-5A)基因的克隆及原核表达 总被引:5,自引:0,他引:5
根据柽柳cDNA文库中获得的eIF-5A基因片段,用RACE技术克隆出其全长cDNA序列.cDNA长度为799 bp,编码159个氨基酸.将该cDNA序列克隆到原核表达载体pET28a中,获得重组质粒pET28a-eIF5A.不同浓度NaCl胁迫下大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(pET28a-eIF5A)比E.coli BL21(pET28a)有明显的抗盐性,前者菌株存活率在1.0 mo1·L-1NaCl盐胁迫下是后者的9.3倍,据此认为E.coliBL21(pET28a-eIF5A)的耐盐性可能与eIF-5A基因的表达相关.该基因的GenBank登录号为AY587771(基因)、AAT01416(蛋白). 相似文献
6.
以牛分枝杆菌 Vallee111 染色体 DNA 为模板,以 MPB63 成熟蛋白基因特异性引物进行 PCR 扩增,获得约 400 bp 的 DNA 片段 . 通过 T-A 克隆技术,将 PCR 产物克隆至 pGEM-T Vector 中,成功地构建出克隆载体 pGEM-T-63. 以 BamH Ⅰ和 EcoR Ⅰ双酶切 pGEM-T-63 和 pET28a(+) ,并将纯化的 MPB63 基因亚克隆至 pET28a (+) 中,构建出原核表达载体 pET28a-63. 将 pET28a-63 转化至感受态 E.coli BL21(DE3) 中,经 IPTG 诱导和 SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳分析,可见约 18 ku 外源蛋白带 . 蛋白质印迹分析发现,该蛋白质具有牛分枝杆菌抗原性,从而为进一步研究 MPB63 的亚单位疫苗及 DNA 疫苗奠定基础 . 相似文献
7.
绿色荧光蛋白的原核表达、纯化以及抗体制备 总被引:2,自引:1,他引:1
郑玥婷 《氨基酸和生物资源》2005,27(1):40-43,45
用PCR扩增出绿色荧光蛋白(GFP)基因,插入到pGEX-KG表达载体中,并将构建出的重组质粒命名为pKG- GFP。将重组载体导入大肠杆菌DH10β中,经IPTG诱导产生GST-GFP融合蛋白,同时以可溶蛋白和包涵体两种形式存在。 GST-GFP分子量大约为53kDa,与其理论值大小一致,用亲和层析以及凝血酶处理纯化GFP。纯化的产物经证实具有很好的 均一性。以GFP免疫新西兰家兔,制备多克隆抗体,Westernblotting测定抗血清效价。 相似文献
8.
肿瘤坏死因子受体(TNFR)是细胞因子受体家族中的一员,在大DNA病毒的免疫逃避中起着重要的作用。 淋巴囊肿病毒中国株(LCDV-C)是一种大DNA病毒,属于虹彩病毒科。参照已知虹彩病毒TNFR基因设计引物: P1,5′GGATCCAAAACTATGATTAAAATAAAGA 3′;P2:5′ATTACTCGAGAATGTTAAAAATTAAGCTT 3′。以LCDV-C基因组DNA为模板,PCR扩增得到一个834bp的DNA片段,并对该片段进行测序。构建原核表 达重组质粒后,在大肠杆菌DE3中诱导表达,其产物经SDS-PAGE电泳后,显示为45kDa的融合蛋白带。对测序 结果进行计算机辅助分析的结果显示,LCDV-C TNFR类似物是一个含278个氨基酸的多肽,具有典型的半胱氨 酸富集区功能结构域,与宿主牙鲆TNFRII氨基酸同源性为34%。 相似文献
9.
人抑癌基因PTEN的原核表达载体的构建及融合表达 总被引:1,自引:0,他引:1
为研究抑癌因子PTEN蛋白的抑癌机理,掏建了PTEN cDNA的原核表达载体并进行融合表达。将含有PTEN cDNA的质粒pMD-PTEN经EcoR Ⅰ和Sal Ⅰ双酶切,回收PTEN基因片段与经相同酶切的高效原核表达载体pET-44a连接,经序列测定,证实融合型表达载体pET-Nus-PTEN构建成功。转化表达宿主BL21(DE3)后,IPTG诱导表达。经12%SDS-PAGE凝胶电泳,获得118kD的特异蛋白条带。目的蛋白占细菌总蛋白的17%。结果表明:PTEN基因和Nus基因融合表达成功,获得可溶性Nus-PTEN蛋白。该研究为PTEN蛋白的抑癌机理和基因工程药物的研究打下了基础,这是国内PTEN蛋白在原核细胞中成功表达的首次报道。 相似文献
10.
从基因库中调取SARS冠状病毒囊膜E蛋白基因序列,用连接PCR方法合成完整片段。测序确认后与人免疫球蛋白(IgG)序列Fc段连接并克隆至原核表达载体pPRO EX Hta中。从SDS—PAGE凝胶中回收表达产物后免疫BALB/c小鼠,经融合、筛选制备特异性单克隆抗体(mAb)。连接PCR扩增出231bp的DNA,测序结果与GenBank公布的序列一致,与人IgG序列Fc段基因连接后克隆至原核表达载体,在大肠杆菌中获得较好表达。表达产物经SDS—PAGE后,在相对分子质量(Mr)约37000处可见1条明显的诱导表达条带。Western印迹的结果表明,该电泳带与SARS患者的恢复期血清呈特异性免疫反应,,从SDS—PAGE凝胶中回收表达产物并免疫BALB/c小鼠,制备出2株抗E蛋白的mAb。这些mAb与SDS—PAGE凝胶上Mr约为37000的蛋白带也呈现很强的免疫反应。所获得的重组表达E蛋白及特异性mAb为进一步建立SARS病毒感染早期诊断的方法奠定了基础。 相似文献